第四讲蛋白质结构解析技术一.pptVIP

(2)侧链羧基的酰胺化保护侧链羧基形成混合酸酐，与哌叮硫氰酸盐（piperidinethiocyanate）进一步作用形成酰胺，以保护侧链羧基。第30页，共82页，星期日，2025年，2月5日(3)烷基化C末端环化成的乙内酰硫脲（TH）衍生物较为稳定而不易被切割，产率不高。选择性地烷基化修饰硫原子，形成烷基化-TH(ATH)衍生物，裂解产率将大大提高。第31页，共82页，星期日，2025年，2月5日(4)修饰侧链羟基（保护）Thr和Ser残基的侧链上具有羟基羟基不稳定，会干扰测序，需要修饰。乙酸酐将羟基乙酰化，但反应不完全。N-甲基咪唑（NMI）和乙酸酐共同作用，将Thr和Ser的羟基乙酰化。第32页，共82页，星期日，2025年，2月5日(5)裂解和衍生C末端ATH衍生物在酸性条件下与硫氰酸盐反应而被裂解生成ATH-氨基酸。新的C末端自动环化形成乙内酰硫脲（TH），而不必重新活化。整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活化，并修饰Asp和Glu侧链羧基，以及Thr和Ser的羟基。(6)ATH-AA分析（常规分析）小结——C末端测序程序羧基活化→侧链羧基保护→烷基化TH–肽→侧链羟基保护→断裂形成ATH-AA→AA分析测定C端第一个和第二个氨基酸工艺的区别第33页，共82页，星期日，2025年，2月5日3、C末端蛋白质序列仪可由N端序列仪改装而成，不同之处主要在于:(1)反应所用的试剂不同，两者不兼容，否则易堵塞管道。C端序列仪：所有的化学反应均在弹筒型反应室中进行，切割下来的ATH-AA仅在转化腔内干燥和溶解后即可进入HPLC系统分离分析。N端测序仪：ATZ-AA需在转化腔中转化为PTH-AA。第34页，共82页，星期日，2025年，2月5日4、C端测序样品前处理纯度鉴定脱盐疏基修饰ε-氨基的衍生第35页，共82页，星期日，2025年，2月5日5、影响C端测序反应产率的因素不同的氨基酸的反应产率不同，图谱分析比N端测序复杂。C端测序副反应较多，最高起始产率仅为20%，GluAspSerThr等残基的产率更低。若C端富含这几种残基，测序十分困难。Pro残基终止测序过程Pro残基有吡咯环，其羧基与乙酸酐反应不能成环。一旦遇到Pro，整个测序过程将终止。到目前为止，C端序列可测l~10个残基，平均3~5个，一次测序需要的量比N端测序要大得多，至少需1nmol。作为N端测序的补充。第36页，共82页，星期日，2025年，2月5日（三）蛋白质一级结构测定步骤蛋白质水解——多个短肽测定——每个短肽的序列序列拼接——蛋白质序列二硫键和酰胺位置的确定第37页，共82页，星期日，2025年，2月5日1、酶解和分离长肽链降解成短肽以利于多肽的序列测定长肽链降解成短肽与氨基酸测序结合进行序列分析长肽链降解成短肽以利于测定肽谱常用酶及降解位点胰蛋白酶Lys、Arg等碱性aa羧基端，不切-Arg-Pro-、-Lys-Pro-胰凝乳蛋白酶芳香aa羧基端胃蛋白酶Phe、Trp、Leu、Ala等aa羧基端梭菌蛋白酶Arg等碱性aa羧基端V8蛋白酶Asp、Glu等酸性aa羧基端Lys内肽酶Lys羧基端优点：专一性强、条件温和、副反应少、水解率高短肽分离：采用HPLC方法——蛋白质分离纯化章节详细介绍方法和原理第38页，共82页，星期日，2025年，2月5日测序不能太长，常常需要酶切测序，肽链拼接。（拼图游戏）根据肽链测序结果若一条简单肽链：仅有1～2个断裂点，根据N和C末端氨基酸，很容易确定其一级结构。若为复杂的肽链：不能只靠一套肽链断裂方法，需要两套甚至更多的断裂方法分别测序，通过查找叠肽的方法，分析确定完整的氨基酸序列。举例说明：（拼图）2、肽链拼接——重叠肽法第39页，共82页，星期日，2025年，2月5日一条15个氨基酸残基组成的多肽，其N末端为His，C末端为Glu。采用两套断裂方法分别测序：第一套将肽段断裂成5个小片段，其序列分别为Lys-Trp-Glu，Cys-Glu，Asp-Lys-Va-Asp，Leu-Pro-Ala和（1）His-Lys-Ile-Tyr。第二套肽段断裂为Glu-Asp-Lys，（4）Ile-Tyr-Lys-Trp，Val-Asp-Leu-Pro，（2）Ala-Cys-Glu和（3）His-Lys。通过N、C末端及重叠肽最后可定编为：His-Lys-Ile-Tyr-Lys-Trp-Glu-