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第1页,共25页,星期日,2025年,2月5日钱永健第2页,共25页,星期日,2025年,2月5日荧光分析法(fluorometry)是利用物质的荧光光谱特征(谱带位置,强度)进行分析的方法。1575年:愈创木切片的黄色溶液可以发出天蓝色荧光1852年:Stokes阐明荧光发射机制(分光计观测奎宁和叶绿素的荧光,发现波长稍长于入射光的波长——认识到荧光为“重新发光”而不是漫射光。第3页,共25页,星期日,2025年,2月5日第一节荧光分析法基本原理一、分子发光分子发光:处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态,然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子,此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。第4页,共25页,星期日,2025年,2月5日(一)分子荧光的产生1.分子能级、荧光及磷光的产生分子能级=电子能级(Ee)+振动能级(Ev)+转动能级(Er)第5页,共25页,星期日,2025年,2月5日第6页,共25页,星期日,2025年,2月5日2.去活化过程(Deactivation)处于激发态分子不稳定,通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括:1)振动弛豫(VibrationalRelaxation,VR)在液相或压力足够高的气相中,处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子,从而从高振动能层失活至低振动能层的过程,称为振动弛豫。2)内转换(InternalConversion,IC)对于具有相同多重度的分子,若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时,则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁,如S2-S1;T2-T1。第7页,共25页,星期日,2025年,2月5日3)外转换(ExternalConversion,EC)受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程,也称“熄灭”或“猝灭”。4)体系间跨跃(IntersystemConversion,ISC)体系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁,如从S1到T1,该跃迁是禁阻的。然而,当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时,处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化,即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁,该过程称为体系间跨跃。第8页,共25页,星期日,2025年,2月5日5)荧光发射分子电子从第一单重激发态(Kasha规则)的最低振动能级在很短时间(10-9-10-6s)跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为荧光。由于各种去活化过程的存在,荧光辐射能通常要比激发能量低,或者说,荧光波长大于激发波长(Stokes效应)。6)磷光发射从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后,再经振动弛豫回到三重态最低振动能层,最后,在10-4-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。第9页,共25页,星期日,2025年,2月5日(二)激发光谱和发射光谱改变激发波长,测量在最强荧(磷)光发射波长处的强度变化,以荧光强度对激发波长作图即得到激发光谱(excitationspectrum)。激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似,经校正后二者完全相同!这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。激发光谱可用于鉴别荧光物质;在定量时,用于选择最适宜的激发波长。第10页,共25页,星期日,2025年,2月5日发射光谱(emissionspectrum)即荧光光谱(fluorescencespectrum)。一定波长和强度的激发光照射荧光物质,产生不同波长和强度的荧光,以荧光强度对其波长作图即为荧光发射光谱。由于不同物质具有不同的特征发射峰,因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。第11页,共25页,星期日,2025年,2月5日激发光谱的特征1.Stokes位移与激发(或吸收)波长相比,荧光发射波长更长。2.荧光光谱形状与激发波长无关不管激发波长如何,电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。3.荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系第12页,共25页,星期日,2025年,2月5日原因解释1:能级结构相似性荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成,即其形状与基态振动能级分布有关。吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成,即其形状与
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