基因重组和基因工程.pptVIP

不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4DNA连接酶15oC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。第62页，共129页，星期日，2025年，2月5日平端连接限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：第63页，共129页，星期日，2025年，2月5日目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15oC重组体载体自连目的基因自连第64页，共129页，星期日，2025年，2月5日在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。同聚物加尾连接第65页，共129页，星期日，2025年，2月5日5′3′3′5′载体DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或机械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′3′3′5′3′A(A)nAA(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4DNA连接酶15oC重组体5′第66页，共129页，星期日，2025年，2月5日由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头(linker)连接第67页，共129页，星期日，2025年，2月5日人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第68页，共129页，星期日，2025年，2月5日受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)四、重组DNA导入受体菌第69页，共129页，星期日，2025年，2月5日将重组体DNA分子导入宿主细胞1、转化指将质粒或其它外源DNA导入感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。2、感染以λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当细胞，并在细胞内扩增。第70页，共129页，星期日，2025年，2月5日3、转染指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。第71页，共129页，星期日，2025年，2月5日特殊处理受体细胞细胞膜特性改变第72页，共129页，星期日，2025年，2月5日CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细菌第73页，共129页，星期日，2025年，2月5日第74页，共129页，星期日，2025年，2月5日直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等五、重组体的筛选第75页，共129页，星期日，2025年，2月5日转化后的克隆群体：第76页，共129页，星期日，2025年，2月5日1、采用遗传学方法筛选特定的重组DNA(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)第77页，共129页，星期日，2025年，2月5日(插入失活法)抗药性标记选择目录第78页，共129页，星期日，2025年，2月5日组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录若克隆基因的表达产物与宿主菌的营养缺陷互补,那么就可以利用营养突变菌株进行筛选,这就是标志补救.第79页，共129页，星期日，2025年，2月5日α互补的检测目录第80页，共129页，星期日，2025年，2月5日2、免疫学方法利用特异性抗体检测表达产物3、核酸杂交法筛选特定DNA第81页，共129页，星期日，2025年