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猪流行性腹泻病毒保护性抗原靶向融合肽乳酸杆菌活菌载体构建与免疫原性探究

一、引言

1.1研究背景与意义

猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病，临床上以呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。自2010年底以来，变异株PEDV在我国大规模爆发，给我国养猪业带来了沉重打击，尤其是对仔猪的危害极大，7日龄以内仔猪的死亡率可高达80%-100%，给养猪业造成了巨大的经济损失。

目前，防控PEDV的主要手段是疫苗接种，但传统的疫苗存在免疫效果不理想、免疫途径单一等问题。因此，开发新型高效的疫苗成为当前防控PEDV的研究热点。乳酸菌作为一种益生菌，具有安全、无副作用、能调节肠道微生态平衡等优点，被广泛应用于食品和医药领域。近年来，利用乳酸菌作为抗原载体表达外源抗原，制备黏膜疫苗成为研究的热点。黏膜免疫是机体抵御病原体入侵的第一道防线，能诱导产生黏膜免疫应答和系统免疫应答，具有免疫途径简单、方便等优点。构建PEDV保护性抗原靶向融合肽乳酸杆菌活菌载体，有望开发出一种新型高效的PEDV黏膜疫苗，为PEDV的防控提供新的策略，对促进养猪业的健康发展具有重要意义。

1.2PEDV概述

1.2.1病原学特征

猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链RNA病毒。病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径约95-190nm，有囊膜，囊膜表面有花瓣状纤突，长约18-23nm。其基因组全长约28kb，包含7个开放阅读框（ORFs），分别编码RNA聚合酶、刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）等结构蛋白以及一些非结构蛋白。其中，S蛋白是PEDV的主要免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体，在病毒的感染和免疫过程中发挥着关键作用。S蛋白由S1和S2两个亚基组成，S1亚基包含受体结合结构域，决定了病毒的宿主范围和组织嗜性；S2亚基则参与病毒与宿主细胞膜的融合过程。

1.2.2致病性与病理特征

PEDV主要感染猪的小肠上皮细胞，通过其表面的刺突蛋白与小肠上皮细胞表面的受体结合，进而侵入细胞内进行复制。病毒感染后，会导致小肠上皮细胞受损、脱落，绒毛萎缩、变短，隐窝加深，从而影响肠道的消化和吸收功能，引起猪只出现呕吐、腹泻、脱水等临床症状。

不同日龄的猪对PEDV的易感性和致病性存在差异。仔猪，尤其是7日龄以内的仔猪，由于其免疫系统尚未发育完全，肠道屏障功能较弱，感染PEDV后病情较为严重，死亡率高。而成年猪感染后症状相对较轻，多呈亚临床感染或轻微腹泻症状，但可作为病毒的携带者，持续向外界排毒，成为传染源。

病理变化主要集中在小肠，表现为小肠黏膜充血、出血，肠壁变薄，肠腔内充满黄色液体，肠系膜淋巴结肿大。组织学检查可见小肠绒毛上皮细胞变性、坏死、脱落，固有层淋巴细胞浸润等。

1.3相关研究进展

1.3.1PEDV疫苗研究现状

目前，针对PEDV的疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗等传统疫苗，以及核酸疫苗、重组病毒载体疫苗等新型疫苗。传统疫苗在一定程度上对PEDV的防控起到了作用，但也存在一些不足之处。例如，灭活疫苗免疫原性较低，需要多次免疫且免疫剂量较大；弱毒疫苗存在毒力返强的风险；亚单位疫苗生产成本较高，免疫效果有待提高。

近年来，基于S基因的新型疫苗研究取得了一定进展。核酸疫苗（如DNA疫苗和mRNA疫苗）具有制备简单、免疫原性强等优点，能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答。重组病毒载体疫苗则是以病毒为载体，将PEDV的S基因插入载体病毒基因组中，通过载体病毒的感染将S基因导入宿主细胞内表达，从而激发免疫反应。然而，这些新型疫苗仍处于研究阶段，在免疫效果、安全性和稳定性等方面还需要进一步优化和完善。

1.3.2靶向性疫苗研究进展

靶向性疫苗是指通过将抗原靶向递送至特定的免疫细胞或组织，以提高疫苗的免疫效果。目前，针对PEDV的靶向性疫苗研究主要集中在M细胞和树突状细胞（DC）靶向性疫苗。

M细胞是位于肠道黏膜上皮的一种特殊细胞，能够摄取肠道内的抗原并将其传递给下方的免疫细胞，在黏膜免疫中发挥着重要作用。将PEDV抗原与M细胞靶向肽融合，可使抗原特异性地被M细胞摄取，从而增强抗原的免疫原性，诱导更强的黏膜免疫应答和系统免疫应答。

树突状细胞是体内功能最强的专职抗原提呈细胞，能够摄取、加工和提呈抗原，激活初始T细胞，启动免疫应答。通过将PEDV抗原靶向递送至DC，可提高抗