叶酸改善双酚A对神经发育毒性及经典Wnt通路信号传导的抑制作用研究.pdfVIP

本研究由

河南省自然科学基金（202300410165）

河南省高等学校重点科研项目（22A330001）

提供资助

摘要

双酚A（BisphenolA,BPA）是典型的环境内分泌干扰物之一，普遍存在于

塑料制品和工业化学品中；已证实，BPA可穿过胎盘屏障和血脑屏障诱发胚胎

神经发育毒性，但目前仍缺乏有效的防治药物。叶酸（FolicAcid,FA）可促进

胚胎神经管的正常发育，降低神经管畸形的发生率。Wnt信号通路精准调控神

经系统的发育，对维持神经系统的结构和功能发挥关键作用。提示Wnt信号通

路可能是解析FA防治BPA致神经发育毒性的作用靶标。因此，本试验选用非

洲爪蟾胚胎和HT-22细胞，旨在研究FA改善BPA致神经发育毒性与经典Wnt

信号传导的作用机制，具体研究内容如下：

1.不同剂量BPA致神经发育毒性与Wnt信号通路的效应关系

选用BPA（1、5、10和15μM）处理非洲爪蟾胚胎96h，观察胚胎发育形

态；10、50、100和150μM的BPA作用HT-22细胞48h，观察细胞形态变化；

qRT-PCR和Westernblot检测Wnt3a和β-catenin因子的相对表达量。结果显

示：BPA诱发胚胎发育异常，抑制Wnt3a和β-cateninmRNA转录水平；BPA

损伤HT-22神经细胞形态，降低Wnt3a和β-catenin蛋白和mRNA的相对表达

量，表明BPA暴露致神经发育毒性，抑制Wnt信号转导，呈量效关系。

2.Wnt信号通路参与BPA致HT-22神经细胞的毒性作用

为了进一步验证Wnt信号通路是否参与BPA致神经细胞的毒性作用，本

试验以HT-22细胞为研究对象，敲降β-catenin沉默经典Wnt信号通路，设Con、

BPA、siβ-catenin、BPA+siβ-catenin，共4组；光学显微镜下观察细胞形态变化；

利用qRT-PCR技术检测突触相关因子(PSD95)、生长相关因子(GAP43)及Wnt

信号通路相关基因转录水平变化。结果显示：与BPA组相比，BPA+siβ-catenin

组的细胞密度降低，树突回缩到胞体、变短。PSD95和GAP43mRNA转录水

平均呈降低趋势，且Wnt3a、FZD、DVL2、β-catenin和TCFmRNA相对表达

量显著降低，证实Wnt通路参与BPA致HT-22神经细胞的毒性作用。

3.FA缓解BPA致非洲爪蟾胚胎神经发育的毒性作用

体内试验探究FA改善BPA致非洲爪蟾胚胎神经发育异常与Wnt信号通

路的作用关系，本试验建立BPA暴露非洲爪蟾胚胎模型，并添加FA和BML

（Wnt通路激活剂）；设Con、BPA、FA、BPA+FA、BML和BML+BPA组，

共6组。待胚胎发育至96h，统计分析胚胎发育终点指标和基础运动能力；利

用全胚胎免疫荧光染色，观察幼虫运动神经元发育情况；采用qRT-PCR技术

检测神经发育相关基因和Wnt信号通路相关基因转录水平变化。结果显示：与

BPA组相比，BPA+FA组幼虫形态趋于正常化，畸形率降低，存活率升高，眼

间距、头长及体长均显著增加；幼虫的运动轨迹恢复为有规律的转圈运动，游

泳距离和速度均得到缓解；幼虫运动神经元排列较为整齐，体节清晰；且

Tubulin3、MAP2、SOX2和Wnt3a、FZD、DVL2和β-catenin基因转录水平显

著升高。BPA+BML组中上述试验结果与BPA+FA组变化趋势基本一致，表明

FA可缓解BPA致胚胎神经发育及经典Wnt通路信号传导的抑制作用。

4.FA改善BPA致HT-22神经细胞的毒性作用

体外试验探究FA改善BPA致神经细胞毒性与Wnt信号通路的作用关系，

本研究选用HT-22细胞，设：Con、BPA、FA、BPA+FA、BML和BML+BPA

组，共6组，作用48h。光学显微镜下观察细胞形态变化；利用CCK-8和LDH

试剂盒测定HT-22细胞活性和膜的通透性；利用ELISA试剂盒测定谷氨酸的

含量；采用Westernblot