液滴数字PCR全过程微流控芯片集成研究.pdfVIP

摘要

在疫病防控、治疗检测、生物工程等多个领域，核酸检测发挥着重要作用。

随着精准医疗、低丰度检测等发展，常用的荧光定量PCR检测手段已无法满足

其精度和灵敏度需求，因此液滴数字PCR技术引起更多关注。同时，在即时检

测（Point-of-CareTesting，POCT）中仍急需高灵敏、防污染、易操作的快速检

测方案，但是目前液滴数字PCR仍缺乏全过程集成的一体式设备，小型化和稳

定性仍有待提高，本文依托微流控技术研究数字液滴PCR全过程芯片集成方案。

液滴数字PCR技术包括液滴生成、核酸扩增、荧光检测三个阶段。均一稳

定的单分散液滴微反应器是实现定量测量的基础。本文采用软光刻技术，以流

动聚焦型生成液滴，依托微尺度流动控制实验台，对比分析了添加表面活性剂

对液滴生成及维持的影响。经95℃30分钟高温加热后，分子热运动加剧界面

张力降低，液滴稳定性下降。其中dSURF（2%surfactantinNovec7500oil）油

包水液滴CV值最小为51.8%，做为后续液滴微反应器制备基础。

针对核酸扩增模块，本文以VOF模型进行液液两相流的数值模拟，分析了

液滴形成机理，探讨了微通道内液滴生成和加热过程，模拟微通道内液滴的受

热情况指导加热模块设计。结果表明，在微通道中液滴可在一个周期长度的1‰

内完成换热需求。并实验对比平面型和空间型两种流式加热方法，进而建立了

本文系统集成的空间型流式加热设备，实现稳定可控的液滴数字PCR加热需求。

准确地读取荧光信号是液滴数字PCR精度的保证。本文基于荧光图像检测

技术，探究高通量荧光可视化数字成像检测方法，建立流动与成像帧率相匹配

的高通量微流控检测芯片，通过微流控通道设计，实现液滴单层、多行的高通

量检测，以满足信号可视化采集需求。使用基于液滴位移判断和位置判断相结

合的多目标追踪图像处理方法直接对可视化荧光图像进行判读，形成较流式细

胞仪检测更高通量的检测效果；较静态荧光图像识别有更高的单液滴图像分辨

率及识别精度，并可避免图像拼接带来的误差。

综上所述，本文搭建了液滴数字PCR全过程微流控芯片集成系统，给出了

系统执行时序表，可在100分钟内完成从制备到检测全过程，为高精度一体式

便携核酸检测提供了参考方案。

关键词：液滴数字PCR；核酸POCT；液滴生成；可视化检测；微流控

Keywords:dropletdigitalPCR,nucleicacidPOCT,dropletgeneration,visual

detection,microfluidics

目录

摘要I

ABSTRACTII

第1章绪论1

1.1课题背景及研究的目的和意义1

1.2国内外研究现状2

1.2.1数字PCR及其检测技术发展2

1.2.2微流控在PCR技术中的应用4

1.2.3核酸POCT设备集成11

1.2.4文献综述简析12

1.3本课题的主要研究内容13

第2章实验系统与数值方法15

2.1实验方法介绍15

2.1.1微尺度流动观测方法15

2.1.2微流控芯片制作16

2.1.3图像处理方法19

2.2液液两相流数值模拟方法20

2.2.1控制方程20

2.2.2流体体积法20

2.3本章小结22

第3章单分散液滴微反应器制备23

3.2液滴生成机理23

3.1.1液滴微流控中的无量纲参数23

3.1.2影响液滴生成的因素25

3.2液滴稳定性实验研究26

3.2.1液滴生成芯片设计26

3.2.2稳定性实验方法27

3.3液滴稳定性实验结果29

3.3.1微通道内液滴生成分析29

3.3.2多次移液的稳定性影响32

3.3.3高温加热的稳定性影响34

本章小结