转基因生物与基因打靶.pptVIP

基因敲除和RNA干扰基因敲除是在基因水平将某个基因定点去除，动物整体水平。RNA干扰不是将基因敲除，而是剪切RNA，干扰基因的表达。一般是在细胞水平。基因打靶在医学中的应用建立人类疾病的动物模型1)遗传病2)肿瘤3)基因治疗鉴定动物和人类的新基因及其生物学功能4）精子载体法外源DNA精子卵细胞受精卵转基因动物共育法脂质体转染法电穿孔法DNA精子受精卵DNA卵细胞DNA胚胎干细胞DNA逆转录病毒感染磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法四细胞胚胎囊胚原肠胚转基因动物微注射显微注射3.下游—基因的整合、表达检测与细胞筛选

随机整合：外源DNA随机整合在染色体DNA的断裂处，注射的DNA末端与断裂点之间的相互作用使外源DNA整合入基因组。DNA线化分子比环状分子的整合效率高的多。因整合位点高度可变，受整合位点周围染色质的影响，转入基因的表达水平及组织特异性均受影响。同源重组/定点整合：通过同源重组的方法将目的基因整合到基因组的特定位点。共整合：将不同基因或不同构件同时注射到同一受精卵，不同的基因构件以首尾相连的形式共整合。内含子对表达的影响：人β-蛋白转基因鼠，第二内含子对表达是必需的。机制不明。转基因鼠的鉴定和鼠系建立染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。转录水平：转基因的mRNA的存在与否以及表达水平。蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。鉴定方法PCRSouthernblot染色体原位杂交NorthernblotRT-PCRWesternblot基因转移鼠纯合鼠系的建立×转基因杂合鼠未转基因鼠生殖系细胞中不含转入基因生殖系细胞中含转入基因子代多次交配可得到纯合转基因鼠系二、转基因动物的应用分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能建立人类疾病的转基因动物模型基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器人类疾病的转基因动物模型完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，并为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。帮助了解疾病的病因和发展过程。转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段。人类疾病的转基因动物模型各种人类遗传病的鼠模型，如：老年性痴呆症(Alzheimer’sdisease)、关节炎(arthritis)、肌肉营养缺乏症(musculardistrophy)、肿瘤发生(tumorigenesis)、高血压(hypertension)、神经退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、内分泌功能障碍(endocrinologicaldisfunction)、动脉硬化症及其他很多疾病。转基因动物模型显微注射β淀粉样蛋白基因得到老年痴呆症的转基因动物模型。显微注射鼠REN-2肾上腺素基因的到原发性高血压的转基因动物模型。为什么要选鼠作转基因动物模型？人类和鼠基因组同源度高，对它进行比较研究可以得知很多关于人类疾病和生理机能的信息，因此了解鼠非常有助于了解人类本身。由于鼠的饲养成本较低、繁殖周期短，产仔数多，基因整合率较高，因此成为转基因动物实验的首选动物。利用转基因动物反应器生产药用蛋白转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物反应器等。抗凝血酶III：转基因绵羊的乳汁中。β乳球蛋白红细胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生长激素转基因改良移植器官改造异种来源器官的遗传性状，使之适应于人体器官或组织的移植。1997年起，利用遗传改良的转基因猪肝做为严重肝病患者的离体生命支持物。动物的克隆1996年，首次实现动物的无性生殖。由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供细胞质发育而来。核移植技术（NuclearTransfer)核移植技术（NuclearTransfer)第二节基因打靶（GeneTargeting)基因打靶：通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。基因敲除(geneknockout):将某个基因定向去除。基因敲入(geneknockin):定向将一段基因序列替代另一段基因序列。一、基因打靶的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞及其鉴定基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系1、打靶载体的构建同源基因片段质粒载体HB1HB2neor基因HSV-tk基因2、打靶载体导入