蛋白质的分离纯化.pptVIP

1透析和超过滤;;基本原理：;

两相：固定相（静相）和流动相（动相）

有效分配系数：

;层析

按流动相：气相、液相色谱等；

按操作形式不同：纸层析、薄层层析、柱层析等；

按分离机制：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等。;3.1纸层析

（Filter-paperchromatography）;3.2薄层层析

（Thin-layerchromatography）;3.3柱层析;①凝胶过滤层析(分子排阻层析、分子筛层析）

（Gel-filtrationchromatography）

;介质：凝胶颗粒（多孔的网状结构）

交联度或孔度（网孔大小）——凝胶的分级分离范围

交联葡聚糖——SephadexG-50（1500-30000）

琼脂糖——Sepharose或Bio-GelA

聚丙烯酰胺——Bio-GelP

;原理：;②离子交换层析

（Ion-exchangechromatography）;第十三页，共三十七页。;第十四页，共三十七页。;第十五页，共三十七页。;第十六页，共三十七页。;

茚三酮反应：

生成紫色物质

脯氨酸和羟脯氨酸生成黄色物质

;第十八页，共三十七页。;根据蛋白质与特异的配体相互作用来分离的。;第二十页，共三十七页。;第二十一页，共三十七页。;;;④高效液相层析

（High-Performanceliquidchromatography,HPLC）;第二十五页，共三十七页。;4电泳(Electrophoresis);4.1凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶（蛋白质和多核苷酸）

琼脂糖凝胶（核酸）;;聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

不连续：浓缩胶和分离胶

电泳迁移率决定于所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。;巯基乙醇：打开二硫键。

SDS：变性剂，破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。

SDS以其氢键与蛋白质分子的侧链结合成复合体。

①带有很多负电荷——远远超过蛋白质分子原有电荷

②改变了蛋白质单体分子的构象：近似雪茄烟形的长椭圆棒，

短轴长度相同，长轴长度随蛋白质的相对分子质量成正比例变化。;第三十一页，共三十七页。;迁移率;4.2等电聚焦电泳

高分辨率的蛋白质分离技术。

在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场的作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。

特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02pH单位的差别就能分开。;第三十四页，共三十七页。;等电聚焦电泳;第三十六页，共三十七页。;谢谢大家！