鼻疽伯氏菌重组聚合酶等温扩增（RAA）检测方法.pdfVIP

ICS11.220

CCSB41

团体标准

T/CVMAXXXXX—XXXX

鼻疽伯氏菌重组聚合酶等温扩增（RAA）

检测方法

Real-timeRAAmethodfordetectionofBurkholderiamallei

征求意见稿

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

前  言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国兽医药品监察所提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：

本文件主要起草人：

T/CVMAXXXXX—XXXX

鼻疽伯氏菌重组聚合酶等温扩增（RAA）检测方法

1范围

本文件规定了鼻疽伯氏菌重组聚合酶等温扩增（RAA）检测方法的试剂材料、仪器设备、样品的

采集与处理、操作方法和结果判定等。

本文件适用于马属动物口/鼻拭子、细菌培养物、疑似马组织病料样品（鼻分泌液、咳出液和溃疡

的脓液等）和血液的核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适

用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541动物疫病实验室检验采样方法

3术语、定义和缩略语

本文件没有需要界定的术语和定义。

4符号和缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ATP：腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosinetriphosphate）；

bp：碱基对（basepair）；

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）；

dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）；

FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）；

HP基因：假定蛋白基因(hypotheticalprotein)；

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OD：光密度值（opticaldensity）；

PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphateBufferedSaline）；

RAA：重组酶介导链替换核酸扩增技术（RecombinaseAidedAmplification）

5试剂和材料

5.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试

剂均用无DNA酶/RNA酶污染的容器分装。

5.2细菌DNA提取液：3mg/mLNaOH，也可以使用等效的商品化试剂盒。

5.3引物及探针，按照附录B配制。

5.4醋酸镁：摩尔浓度为280mM。

5.5聚乙二醇35000：质量百分比为10%。

5.6基础RAA预混液（2.5×）：三羟甲基氨基甲烷‑醋酸缓冲液20mM，醋酸钾120mM，二硫苏糖醇

8mM，ATP3mM，磷酸肌酸20mM，肌酸激酶30ng/μL，重组酶uvsX350ng/μL，单链结合蛋白gp32

500ng/μL，重组酶uvsY50ng/μL，枯草芽孢杆菌聚合酶I大片段（

exo‑）10Units，dNTPs450μM。也

可以使用等效的商品化试剂。

5.7阳性对照，鼻疽伯氏菌HP基因片段重组质粒（序列见附录A）或鼻疽伯氏菌基因组DNA核酸。

5.8阴性对照，pMD18-