基于多种质谱技术的阿卡地新溯源方法建立及代谢研究.pdfVIP

摘要

研究目的：

阿卡地新（AICAR）是一种代谢调节剂，属于世界反兴奋剂机构（WADA）

禁用物质清单中的S4类。目前针对该内源性物质，其检测主要集中于定性和定

量，由于个体差异较大，无法建立有效的人群阈值，因此难以直接界定内外源性。

本论文将以AICAR为研究对象，一方面实现溯源检测方法的建立：拟通过建立

全自动高效二维液相的方法进行分离纯化，并基于带有程序升温（PTV）进样模

式的气相色谱-稳定同位素比质谱（GC-IRMS），形成碳同位素比值（CIR）的溯

源检测标准方法。同时，通过开发检测AICAR中氮同位素比值（NIR）和氢同

位素比值（HIR）新方法，形成多维度指纹图谱溯源指标，以完成对其内外源性

的判别。初步实现液相色谱-稳定同位素比质谱（LC-IRMS）溯源检测AICAR方

法的初步探索。另一方面，对尿液进行AICAR关联性代谢研究。通过非靶向代

谢组学技术分析运动样本和AICAR受试样本中的差异代谢物，以寻找相关的代

谢通路。同时，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对尿液中的AICAR进行

靶向定量检测，分析相关人群体内AICAR的浓度变化趋势。本研究所建立的溯

源方法及代谢指标将进一步为AICAR在兴奋剂检测溯源领域提供参考。

研究方法：

1.针对二维液相以及稳定同位素比质谱方法的建立：本实验招募健康志愿

者，进行一次口服AICAR药物干预，收集受试前三天空白尿样、药物干预后0～

72h的全部尿液样本以及第4天、第5天的晨尿。样本前处理后，利用建立的液

相方法分离纯化样本中的AICAR、11-OH-A、A和PD，其中AICAR在衍生化

后进行C、N、H的同位素检测，对检测的值进行相关的公式校正。基于同位素

比质谱，建立GC-IRMS和LC-IRMS检测方法。

2.针对尿液的代谢分析：本研究选取了两类研究对象，一类是参与散打训

练的学生，收集其运动前、后以及恢复期的尿样作为运动样本，另一类是收集参

与AICAR药物受试志愿者的尿液样本。基于LC-MS/MS建立AICAR定量检测

技术，对运动样本以及AICAR受试样本进行靶向定量，分析运动前后、受试前

后体内AICAR浓度的变化趋势。同时，基于高分辨液质对运动训练样本以及

AICAR受试样本进行非靶分析，对获得的数据使用多元统计分析，筛选条件为：

P＜0.05，变量投影重要度（VIP）＞1，差异倍数（FC）＞1.5或FC＜1/1.5，最

后进行差异代谢物的代谢通路分析。

研究结果：

1.成功建立了针对AICAR及其内源性参考化合物（ERC）11-OH-A、A和

PD的二维液相分离纯化方法，相较于多次离线分离的方法自动化程度高，具备

分离高效、分析时间大幅缩短、样本损失率减小等优点。

2.成功建立了针对AICAR的LC-MS/MS定量检测方法，其线性范围为

10-10000ng/mL，检测限（LOD）为1ng/mL，定量限（LOQ）为10ng/mL。使

用该方法对运动训练样本检测发现，AICAR浓度在运动后有不同程度的上升。

对受试前后的所有样本进行检测发现，AICAR浓度在受试后0-16h超过体内基

础值，呈明显上升趋势，6-12h左右浓度达到峰值，24h后可基本恢复。

3.成功建立了针对AICAR的GC-IRMS检测方法，可检测得到CIR、HIR

及NIR同位素比值结果。该方法采用PTV进样模式，经方法验证，证明了该方

法的可靠性和有效性。其中，通过与ERC的δ13C值做差得到Δδ13C，0-16h内

的样本具有阳性特征，其Δδ13C＞4‰，16h之后的样本具有阴性特征，其Δδ13C

＜4‰。

4.非靶向代谢组学分析发现运动后cAMP通路被激活、γ-氨基丁酸（GABA）

下调、逆行内源性大麻素信号通路更加活跃。受试后AICAR显著上调，PC、PE

和LPE有所下调。

研究结论：

1.本研究建立了快速定量检测AICAR的LC-MS/MS方法，可用于日常检

测。

2.本研究建立了二维液相色谱/气相同位素比质谱（2D-HPLC/GC-IRMS）

方法，可