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Westernblotting

ImmunalBlotting什么是blotting?印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。blotting起源1975年,科学家Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段,最先建立了印迹的方法(Southernblotting)。Westernblotting名字由来而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。Westernblotting定义免疫印迹(westernblotting)是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应(ELISA)高特异性和高敏感性相结合。WesternBlot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。为什么要做WB?目标蛋白检测目标蛋白定性定量多目标同时检测双色-EMSAEGF对ERK磷酸化水平的调控组织样本制备

细胞样本制备细胞裂解液:50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40,0.05%PMSF,2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin,pH8.0蛋白样品的定量Bradford法Lowry法BCA法WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶成份丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺??SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶浓度与蛋白分离范围WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转印膜选择转膜确认丽春红S的使用Prestain?蛋白质预染MarkersWesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳目标检测ThankYou!双通道同时检测TargetproteinAnti-rabbit800channelNormalizertargetAnti-mouse700channel*Two-colordetectionrequiresprimaryantibodiesfromdifferenthostsWesternBlot常见问题分析SDS电泳胶不平?凝胶漏液?胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀,使其充分混合,防止部分胶块聚合不均匀温度合适,受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄?“微笑”或“倒微笑”条带?凝胶聚合不均匀,灌胶时候尽量混合均匀,动作轻缓拔梳子要迅速,清洗加样孔要小心,以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一,纯化样品,调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果,应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲?条带歪斜或漂移?单个或多个白点?转膜缓冲液过热?可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄,“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间多垫几层滤纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。转膜过程注意降温*Marker+靶蛋白对照(or上样量校正蛋白)+靶蛋白总蛋白+修饰化蛋白靶蛋白+靶蛋白核酸+结合蛋白Noneedtostrip!Noneedtore-probe!BindingofT7RNAPtotwoDNAfragmentscontainingtheT7promotersequence,labeledwitheitherIRDye700(red)orIRDye800(green).700and800Overlay700nmChannel800nmChannelDNA-ProteinComplexUnboundDNAIRDye800UnboundDNAIRDye700双色-EGFR的磷酸

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