氨基酸多肽和蛋白质类药品检验.pptVIP

第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验（3）Ando氏微量测定法取肝素抗凝全血，经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，取单个核细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成5×105/ml细胞悬液，置37℃、5％CO2孵箱中培养10天后，用Hanks液将细胞洗两次，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成2×105/mL细胞悬液。用96孔细胞培养板，每孔加入100μL不同稀释度的待测样品，同时设置培养液对照和各种浓度的标准品对照，再向各孔中加入100μL的细胞悬液。置37℃、5％CO2孵箱中培养4d，然后每孔中加入74kBq3H-TdR，继续培养4h后，收集细胞，用液闪计数仪检测细胞的3H-TdR掺入值，计算样品的活性。第94页，共151页，星期日，2025年，2月5日第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验4、微量酶检测法（MTT）法该法通过比较待测样品刺激检测细胞增殖能力的强弱来确定样品的活性。细胞增殖反映能量代谢活跃，可产生大量的能量，供合成多种大分子物质和细胞分裂所需，细胞能量代谢的水平与细胞合成DNA水平基本平行，因此，测定细胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞的增殖情况。第95页，共151页，星期日，2025年，2月5日第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验四甲基偶氮唑盐[3-（4,5-dimethyhhiazol-2-y1）-2,5-di-phenyhetrazoliumbromide，MTT]是一种淡黄色的可溶性化合物，活细胞特别是增殖期的细胞可通过线粒体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状Formazan沉积于细胞内或细胞周围，而且Formazan的量与细胞的增殖程度呈正比，Formazan经异丙醇作用后可溶解显色。第96页，共151页，星期日，2025年，2月5日第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验Mosman等（1983）根据上述原理首创了MTT比色分析法用于检测能够刺激细胞增殖的生物样品的活性。（1）主要试剂MTT溶液将MTT按5mg/mL浓度溶解于PBS中，过滤除菌后，置4℃下避光保存。酸化异丙醇含0.04mol/L盐酸的异丙醇。第97页，共151页，星期日，2025年，2月5日第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验（2）方法用含10％小牛血清的RPMI1640培养液将检测细胞（例如CTLL-2或ConA活化的小鼠脾细胞）配成5×105/mL细胞悬液。向96孔细胞培养板的每孔加入100μL上述细胞悬液，再取100μL不同稀释度的待测样品和各种浓度的标准品对照品分别加入各孔中，每个稀释度3个复孔，并同时设置培养液对照孔。置37℃、5％CO2孵箱中培养48h。第98页，共151页，星期日，2025年，2月5日第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验离心（1500r/min、5min），从各孔中轻轻吸取100μL上清液，弃去，各孔再加入10μLMTT溶液，置37℃、5％CO2孵箱中孵育4～6h。各孔中加入100μL酸化异丙醇，并充分混合，静置数分钟，让形成的Formazan充分溶解。在酶标仪上选择检测波长590nm、参考波长630nm测定OD值，将待测上清的OD值与标准品OD值比较，即得待测样品的活性。第99页，共151页，星期日，2025年，2月5日第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验（3）MTT法的优点与3H-TdR掺入法相比，MTT法操作简便，测定时间大大缩短（特别是一次性测定大量样品时），而且避免了使用放射性同位素和购置昂贵的设备，所需试剂仅是MTT和酸化异丙醇。第100页，共151页，星期日，2025年，2月5日第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验（4）应注意的问题①酸化异丙醇后要在1h内进行测定，如1h内无法测定，可将未加酸化异丙醇的细胞培养板暂放在4℃中保存，测定前将细胞培养板取出，在室温放置数分钟后再加入酸化的异丙醇进行测定。②在每孔中含有100～50000个检测细胞时，细胞数与所测的OD值呈正相关。③因为酚红可以干扰OD值的测定，所以，MTT法最好选用无酚红的RPMI1640培养液，但这种培养液目前在我国难以购买，可以设置RPMI1640培养液对照孔以排除酚红的影响。第101页，共151页，星期日，2025年，2月5日第二节多肽因子类和蛋白质类药品检验（5）改良MTT法为了能更加简便、快速地一次测定大量样品，Tada等（1986）对MTT法在以下几方面进行了改良：①将加MTT前的培养时间从48h缩短为24h；②用10％SDS-0.01mol/LHCl代替酸化异丙醇溶解Formazan结晶，避免了人工混匀和异丙醇