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DF-1细胞与激流式生物反应器联用大规模增殖IBDV的关键技术与应用研究

一、引言

1.1研究背景与意义

传染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV）是一种对家禽业危害极大的病原体，它主要感染鸡和火鸡，尤其是3-6周龄的雏鸡。IBDV主要侵害鸡的法氏囊，法氏囊作为鸡重要的免疫器官，一旦受损，鸡的淋巴细胞被破坏，会引发严重的免疫抑制。感染IBDV的病鸡临床表现为精神沉郁、羽毛蓬松、采食量下降，伴有间歇性腹泻及震颤，常呈蹲伏状，排出黄白色黏稠或水样稀粪。剖检可见法氏囊外观肿胀或萎缩，呈黄色胶冻样或紫葡萄样，囊腔内有大量黏液及出血点，胸肌和腿肌出血，肌胃腺胃交界处出血，肾脏肿大并伴有尿酸盐沉积。

IBDV的传播途径主要为呼吸道与消化道，其病程短、发病快、死亡率高、传播迅速，控制难度极大，在全球各地广泛流行，给家禽养殖业造成了严重的经济损失，已被世界动物卫生组织列为重要家禽疫病之一。在中国，肉鸡养殖规模庞大，IBD流行普遍。据信得科技检测中心数据显示，2023年-2024年上半年共检出705个IBD阳性场，阳性率37.5%，阳性场主要分布于山东和辽宁，河北、河南、山西、江苏和福建地区也有较多检出，肉鸡检出占比93.9%，感染主要集中在4-6周龄。并且IBDV常与其他病原体如IBV、CAV、ARV和H9等发生混感，进一步增加了防控的复杂性。

IBDV分为血清1型及血清2型，其中血清1型对鸡具有高度传染性，血清2型不具有致病性，且两种血清型之间无交叉保护。血清1型毒株根据VP2基因又可细分为经典毒株（cIBDV）、弱毒株（aIBDV）、变异株（vIBDV）、新型变异株（nVarIBDV）及超强毒株（vvIBDV）。近年来，病毒的变异使得防控形势愈发严峻。自2023年以来，超强株（vvIBDV）分支毒株进化出新的分支——超强株变异株（nvvIBDV），nvvIBDV的VP2蛋白有4个关键氨基酸位点发生显著变化，导致鸡感染后的临床症状与新型变异株（nVarIBDV）感染后的症状相似。免疫攻毒保护实验结果表明，传统的vvIBDV疫苗无法对nvvIBDV提供足够的保护，而nvvIBDV疫苗对nvvIBDV和vvIBDV均具有良好的免疫保护作用。nvvIBDV已成为优势流行毒株，并与nVarIBDV共同成为当前的主要流行毒株，这无疑给IBD的防控带来了更大的挑战。

目前，控制IBDV的主要手段是疫苗接种，但由于病毒的不断变异，现有的疫苗难以对新出现的毒株提供有效的保护。因此，开发有效的疫苗成为控制IBDV的关键。而疫苗的研发和生产离不开高效的病毒增殖技术。传统的病毒增殖方法存在产量低、质量不稳定等问题，难以满足大规模疫苗生产的需求。

随着细胞培养技术的发展，利用动物细胞培养来增殖病毒成为研究热点。DF-1细胞是一种选自家禽胚胎的成纤维细胞株，具有良好的细胞生长能力、较高的病毒感染率和较低的转化率，且细胞培养过程中容易管理，被广泛应用于家禽病毒研究。激流式生物反应器是一种自动化的细胞培养设备，其原理是利用搅拌和气体调节这两种动力把营养物质传递到细胞培养系统中，同时排出废物。该系统能够在更高效、更均匀的条件下促进细胞的生长，减轻人工操作对细胞长期稳定培养的影响，可应用于大规模生产细胞和病毒。

本研究旨在探索利用DF-1细胞和激流式生物反应器大规模增殖IBDV的方法，通过优化细胞培养条件和病毒增殖条件，提高IBDV的产量和质量，为IBD疫苗的研发和生产提供技术支持，从而有效控制IBDV的传播，减少其对家禽业造成的经济损失，保障家禽养殖业的健康发展，同时也为其他病毒的大规模增殖研究提供参考和借鉴。

1.2国内外研究现状

在DF-1细胞培养方面，国内外学者已开展了诸多研究。DF-1细胞作为一种源自家禽胚胎的成纤维细胞株，因其具有良好的细胞生长能力、较高的病毒感染率和较低的转化率，且易于管理等优点，在病毒研究领域应用广泛。国内有研究对DF-1细胞的培养条件进行了优化，如探索不同培养基、血清浓度、温度等因素对细胞生长的影响。结果发现，在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃培养时，DF-1细胞生长状态良好，细胞增殖速度较快。国外也有相关报道，通过调整培养条件，成功实现了DF-1细胞的高密度培养，为后续的病毒增殖实验奠定了基础。

在激流式生物反应器应用研究方面，近年来取得了显著进展。激流式生物反应器利用搅拌和气体调节将营养物质传递到细胞培养系统并排出废物，能在高效、均匀的条件下促进细胞