TALEN技术原理及应用.pptxVIP

TALEN技术概述TALEN(转录激活样效应物核酸内切酶)是一种新型的基因编辑技术,通过定制化的DNA结合蛋白与FokI双链切割酶的融合实现了对目标基因组的精准修饰。TALEN技术具有高效、简单、灵活等优点,广泛应用于基础研究、疾病治疗、农业生产等领域,在基因组编辑领域占据重要地位。1yby123yin

TALEN的结构组成1FokI双链切割酶TALEN的核心组成部分,能够特异性切割双链DNA2TALEnDNA结合蛋白通过重复序列域识别目标基因组DNA序列3两个连接肽将FokI双链切割酶与TALEnDNA结合蛋白连接TALEN的核心结构由三部分组成:FokI双链切割酶、TALEDNA结合蛋白和两个连接肽。FokI酶能够特异性切割目标DNA,而TALE蛋白通过重复序列域识别并结合目标基因组序列,连接肽则将两者连接在一起,形成一个可编程的基因编辑工具。

TALEN的识别原理1DNA序列识别TALEN的TALEDNA结合蛋白通过特定的重复序列识别目标基因组上的DNA序列。每个重复单元能识别一个核苷酸。2FokI双链切割TALEN上的FokI双链切割酶在找到目标DNA序列后发生二聚化,进而切割双链DNA,创造出双链断裂。3基因组修饰细胞内的DNA修复机制会利用非同源末端连接或同源重组修复这些DNA断裂,从而实现对目标基因组的精准编辑。

TALEN的设计流程目标基因组分析首先需要对目标基因组序列进行分析,确定待编辑的具体位置和DNA序列。TALE识别序列设计根据目标基因组序列,设计能够特异性识别的TALEDNA结合蛋白序列。TALEN构建与表达将TALE序列与FokI切割酶融合,构建完整的TALEN基因序列,并在细胞中表达。TALEN活性测试通过细胞水平验证TALEN是否能够有效切割目标DNA序列,确保其编辑功能。靶向效率优化必要时可对TALEN的结构和序列进行进一步优化,提高其在目标基因上的切割效率。

TALEN的制备方法1基因合成通过基因合成技术获得TALEDNA结合蛋白的编码序列2蛋白表达将TALE基因序列克隆到表达载体中,在细胞内表达重组TALE蛋白3蛋白纯化采用层析技术从细胞中分离纯化TALE蛋白4融合构建将纯化的TALE蛋白与FokI双链切割酶进行融合,形成完整的TALEN复合体TALEN的制备过程主要包括四个关键步骤:首先通过基因合成获得TALEDNA结合蛋白的编码序列,然后在细胞内表达该重组蛋白,接着采用层析方法分离纯化TALE蛋白,最后将其与FokI酶融合形成完整的TALEN基因编辑工具。这一系列制备过程确保了TALEN的高效性和特异性。

TALEN的基因编辑机制1双链DNA断裂TALEN的FokI双链切割酶在识别并结合目标DNA序列后发生二聚化,从而切断双链DNA,形成双链断裂。2DNA修复机制细胞内启动非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)等DNA修复过程,以修复这些双链断裂。3基因组编辑NHEJ可能引入小型插入或缺失突变,HR可以进行精准的碱基替换或插入,实现对目标基因的精准修饰。TALEN利用其双链切割功能引发细胞内的DNA修复机制,通过NHEJ和HR两种途径实现对目标基因组的精准编辑。NHEJ可能会导致小型插入缺失突变,而HR可以实现特定碱基的替换或插入,从而实现对基因序列的精准修正。TALEN技术巧妙地利用了这些细胞天然的DNA修复过程,使基因组编辑成为可能。

TALEN的靶向特异性1DNA序列识别TALEN能够通过其TALEDNA结合蛋白精准识别并结合目标基因组上的特定DNA序列。每个TALE重复单元都对应一个核苷酸碱基。2FokI二聚化切割当TALE蛋白识别到目标序列后,TALEN上的FokI双链切割酶就会发生二聚化,在识别位点处切断DNA双链。3高度特异性TALEN可以设计成仅识别和切割目标基因组的特定DNA序列,不会对其他非靶序列产生切割,具有很高的靶向特异性。

TALEN的定位策略基因组靶标分析首先需要分析基因组序列,选择合适的目标位点进行TALEN编辑。TALEN设计与构建根据目标序列定制TALE结合蛋白,并将其与FokI酶融合构建TALEN基因。细胞内导入表达将TALEN基因导入目标细胞,利用细胞内表达系统表达并积聚TALEN蛋白。基因组定位切割TALEN蛋白定位并结合目标DNA序列,FokI酶发生二聚化切断双链DNA。

TALEN在细胞系中的应用1基因编辑通过TALEN精准切割目标基因,实现基因敲除、插入或替换等基因组编辑。2细胞株构建在细胞系中应用TALEN,可快速构建各类基因敲除或修饰的细胞株。3功能验证利用TALEN编辑的细胞系,可深入研究基因功能,验证目标基因在生物学过程中的作用。TALEN技术在细胞系研究中广泛应用,能够实现对目标基因的精准编辑,构建各种基