细胞凋亡检测技术.pptVIP

c-myc:一种癌基因，它能诱导增殖，也能诱导细胞凋亡，具有双向调节作用。作用机制：c-myc蛋白为重要的转录调节因子，既可介导细胞增殖的基因，也可激活介导细胞凋亡的基因，其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境（有生长因子→增殖，无生长因子→凋亡）。Bcl-x：能翻译Bcl-XL和Bcl-Xs两种蛋白，Bcl-XL蛋白抑制细胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡（合成以谁为主）3.c-myc,Bcl-x第30页，共73页，星期日，2025年，2月5日五、细胞凋亡的发生机制（一）氧化损伤氧化损伤的后果之一：细胞凋亡依据：①各种氧化剂（H2O2）可直接诱导细胞凋亡②抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可诱导细胞凋亡③抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（TNF-а、电离辐射）引起的细胞凋亡第31页，共73页，星期日，2025年，2月5日①引起DNA损伤，激活P53基因②引起DNA损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭NAD，消耗大量ATP③攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化，细胞膜损伤或产生过氧羟基24碳四烯酸④激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶⑤细胞膜损伤，Ca2+内流增多及损伤线粒体，通透性增加膜电位改变⑥活化核转录因子NF-кB、AP-1，加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：第32页，共73页，星期日，2025年，2月5日（二）钙稳态失衡细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据：①各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程②凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）③钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（神经退行性疾病）第33页，共73页，星期日，2025年，2月5日①激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链②激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成③激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达④Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：第34页，共73页，星期日，2025年，2月5日（三）线粒体损伤线粒体的改变：线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电位（△ψm）下降，能量代谢水平显著降低线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用依据：①抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡②在细胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体内膜跨膜电位（△ψm）下降③阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡（Bcl-2）第35页，共73页，星期日，2025年，2月5日线粒体改变引起细胞凋亡的机制：Ca2+NO缺血原卟啉Ⅸ活性氧线粒体△ψm下降Bcl-2(-)PTP开放Apaf+Cyt.CCaspase-9酶原Caspase-9(+)Caspase-3酶原Caspase-3(+)Caspase抑制剂AIF(-)蛋白质水解细胞凋亡DNA断裂无活性核酸内切酶核酸内切酶激活(+)(+)第36页，共73页，星期日，2025年，2月5日第二节细胞凋亡的检测方法细胞凋亡检测方法：归纳起来，可分三方面，即根据凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。本节主要介绍细胞凋亡的常用病理学检测方法。第37页，共73页，星期日，2025年，2月5日一、苏木精-伊红染色方法(HE染色)1．石蜡组织切片HE染色（略）2．细胞爬片或细胞涂片的HE染色第38页，共73页，星期日，2025年，2月5日（1）细胞爬片或细胞涂片的制备：贴壁生长细胞(包括肿瘤细胞)：让细胞生长在盖玻片使其在上面爬行生长。取出盖玻片，经PBS轻轻漂洗后，用4%的甲醛或多聚甲醛在常温下固定5－10min，即可染色。悬浮生长细胞(包括肿瘤细胞)或贴壁生长的细胞经消化脱壁成单细胞悬液后，可经细胞涂片后染色。（2）染色方法:同石蜡组织切片HE染色，免去第1和第2步。第39页，共73页，星期日，2025年，2月5日【结果判断】1.光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布，表现为核染色质致密浓缩，核碎裂等。2.在细胞爬片上，凋亡的细胞变圆、变小，可见细胞核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色；可见细胞膜皱折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体(apoptoticbodies〉。而正常细胞经染色