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实验六肉品中细菌总数和大肠菌群的测定

一、实验目的

掌握肉品中细菌总数和大肠菌群测定的原理与操作。

二、实验器材

1.主要试剂与材料

（1）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（2）无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

（3）无菌培养皿：φ90mm。

（4）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

（5）放大镜或/和菌落计数器。

（6）平板计数琼脂培养基

（7）结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）

（8）无菌磷酸盐缓冲液

（9）无菌生理盐水

（10）1mol/LNaOH溶液

（11）1mol/LHCl溶液

2.相关溶液与培养基的配制

（1）平板计数琼脂培养基：胰蛋白胨5.0ｇ、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g、

蒸馏水1000mL。将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装于适宜容

器，121℃高压灭菌15min。

（2）结晶紫中性红胆盐琼脂：称取蛋白胨7.0g、酵母膏3.0g、乳糖10.0g、氯化钠5.0g、

胆盐或3号胆盐1.5g、中性红0.03g、结晶紫0.002g、琼脂15g～18g，溶于1000mL蒸馏

水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH至7.4±0.1。煮沸2min，将培养基融化并恒温至45℃～

50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。

（3）煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤：称取蛋白胨10.0g、乳糖10.0g溶于约500mL蒸馏

水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0～

7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7.2±0.1，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用

蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃

高压灭菌15min。

（4）无菌磷酸盐缓冲液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL

的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：

取上述贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。

（5）无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

（6）1mol/LNaOH溶液：称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。

（7）1mol/LHCl溶液：移取浓盐酸90mL，用无菌蒸馏水稀释至1000mL。

3.主要仪器

（1）恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。

（2）冰箱：2℃～5℃。

（3）恒温装置：48℃±2℃。

（4）恒温水浴箱：46℃±1℃。

（5）天平：感量为0.1g。

（6）均质器。

（7）振荡器。

三、实验步骤

1．细菌总数测定

（1）细菌总数测定的程序图（图1）

图1细菌总数测定的程序图

（2）样品的稀释：

①称取25g肉样品置于盛有225mL无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水的无菌均质杯内，

8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用

拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的样品匀液。

②用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL

稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），在振荡器上振荡混匀，制

成1：100的样品匀液。

③按②操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管

或吸头。

④根据对样品污染状况的估计，选择1个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包

括原液），吸取1mL样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。同时，分别吸

取1mL空白稀释液加入两个无菌培养皿内作空白对照。

⑤及时将15mL～20mL冷却至46℃～50℃的平板计数琼脂培养基（可放置于48℃±2℃

恒温装置中保温）倾注培养皿，并转动培养皿使其混合均匀。

（3）培养：水平放置待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2