Lkb1_PD-L1轴在AML来源骨髓MSCs调控T细胞增殖的作用机制研究.pdfVIP

福建医科大学硕士学位论文

目录

摘要1

ABSTRACT3

前言5

实验材料7

实验方法11

结果23

讨论28

结论30

参考文献31

中英文缩略词表37

综述38

致谢52

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Lkb1/PD-L1AMLMSCsT

轴在来源骨髓调控细胞增殖的作用

机制研究

摘要

研究背景与目的：骨髓间充质干细胞（MSCs）在急性髓系白血病（AML）

骨髓微环境的调控中扮演着重要作用。课题组前期发现AML患者来源的骨髓

MSCs在增殖、衰老、对造血干细胞支持以及细胞因子分泌上均存在异常。此外，

课题组前期还发现LKB1是羊膜MSCs免疫调控能力的一个重要调节因子。因此，

我们猜测LKB1在AML来源的骨髓MSCs可能在骨髓免疫微环境调控中扮演着

重要作用。本研究旨在探索LKB1在骨髓MSCs抑制T细胞增殖调控作用及其可

能的相关机制。

方法：利用梯度离心法分离获得AML患者和健康对照组（HC）的骨髓单个

核细胞，利用贴壁法分离获得骨髓MSCs，并利用流式细胞术鉴定骨髓MSCs的

细胞表面标志物。成脂、成骨和成软骨诱导实验对骨髓MSCs的分化潜能进行鉴

定。利用RT-PCR法在mRNA水平上检测AML患者和HC来源的骨髓MSCs中

LKB1表达。利用shRNA技术和慢病毒转染技术，敲低骨髓MSCs细胞系（HS-5

KD

细胞）LKB1表达，并获得LKB1低表达的HS-5细胞（HS-5-LKB1），利用RT-PCR

KD+

和Westernblot验证HS-5-LKB1细胞株LKB1敲低效率。利用流式分选获得CD4

+

T细胞，建立体外HS-5与CD4T细胞共培养体系，利用CFSE染色法检测共培

+KD

养体系的CD4T细胞增殖。此外，流式细胞术检测HS-5-LKB1中PD-L1表达

水平。Wnt信号通路是LKB1调控PD-L1表达的重要通路，利用Westernblot检

测Wnt信号通路相关蛋白质。

结果：

1.本研究成功分离获得骨髓MSCs，其形状呈纺锤形，流式鉴定结果表明骨

髓MSCs不表达CD34与CD45，高表达CD44、CD73、CD90和CD105。诱导分

化实验表明骨髓MSCs具有向成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞分化的潜能。

2.在转录水平上，AML患者来源的骨髓MSCs中LKB1表达水平显著低于

HC来源的骨髓MSCs。

3.利用shRNA技术成功在HS-5细胞敲低LKB1，并获得低表达细胞株

1

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KD

（HS-5-LKB1），并在转录组水平和蛋白水平上得到验证。流式细胞术检测结果

KD

发现HS-5-LKB1高表达PD-L1。

+KD

4.将外周血CD4T细胞与HS-5-LKB1共培养，发现敲低LKB1的HS-5

+

细胞抑制CD4T细胞增殖能力增强，并且anti-PD-L1阻断剂可