第2章DNA重组限制性内切酶与DNA片段化.pptVIP

偏爱位点P42切割位点两侧序列的核苷酸组成亦与切割效率有关，即某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割第31页，共48页，星期日，2025年，2月5日2.7反应系统底物：纯，线性，有保护序列酶：样品，识别序列的密度，容积活性反应缓冲液反应条件第32页，共48页，星期日，2025年，2月5日大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume20--100μl反应温度、时间37℃，1--1.5hr0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶第33页，共48页，星期日，2025年，2月5日1）DNA纯度：要求较纯因素：蛋白质、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高浓度金属离子措施：增加酶的用量；扩大反应系统体积延长反应时间；添加亚精胺2.7.1底物第34页，共48页，星期日，2025年，2月5日2)DNA的甲基化程度核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中，质粒DNA是来源于甲基化酶缺陷型的大肠杆菌菌株。这样制备的质粒DNA，其中的内切酶识别序列没有甲基化，不受限制。第35页，共48页，星期日，2025年，2月5日3）DNA分子构型效率：线性DNA分子大于超螺旋质粒DNA环状病毒DNA第36页，共48页，星期日，2025年，2月5日4）识别序列的侧面序列限制酶切割DNA，对识别序列两侧的非识别序列有长度要求，只含识别序列的寡核苷酸是不会被酶切的，故通常要在识别序列两侧多加若干个核苷酸第37页，共48页，星期日，2025年，2月5日试剂公司提供的包装说明书会标明酶活性单位数和容积活性，最佳作用条件2.7.2内切酶决定酶的用量酶本身的催化活性底物DNA的样品1.用量第38页，共48页，星期日，2025年，2月5日2酶活单位1个酶活单位：在最适反应条件下，在20?l反应液中反应1小时，使1?g?DNA（标准DNA）完全消化所需的酶活性称为1个单位。（教材P43）1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA（λDNA）所需的酶量容积活性：1μL酶液中具有的酶活性单位，即U/μL。Q：某公司产品——内切酶a标注为200U/μL，现有提取到50ug的λDNA，问：在最佳反应条件下反应1小时，需要多少体积的内切酶a？第39页，共48页，星期日，2025年，2月5日常规缓冲液pH，Mg++，DTT/β-ME，(10X)pH7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl，乙酸离子强度：NaCl高中低100mM50mM0③Mg++10mMMgCl2，MgAc2.7.3反应缓冲液对绝大多数限制酶来说，在pH=7．4的条件下，其功能最佳。第40页，共48页，星期日，2025年，2月5日大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃一部分为50-65℃少数25-30℃高温作用酶于37℃时活性多数10-50%TaqI(65℃)10%，ApoI(50℃)50%销售商在产品说明中会标明最佳反应温度2.7.4反应温度第41页，共48页，星期日，2025年，2月5日2.8staractivity1、概念高浓度的酶（100U/?g）、高浓度的甘油（5%）、低离子强度（25mM）、极端pH值(pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的staractivity现象低特异性：可在不是原来的识别序列处切割DNA是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点第42页，共48页，星期日，2025年，2月5日2、抑制staractivity的措施①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度②保证反应体系中无有机溶济或乙醇③