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重组可溶性人干扰素-γ工程菌培养条件优化研究：提升蛋白表达与活性的关键探索

一、引言

1.1研究背景

人干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）作为一种具有多效性的细胞因子，在医学领域发挥着至关重要的作用。它主要由激活的T细胞和自然杀伤（NK）细胞分泌，在人体的先天免疫和适应性免疫中都扮演着核心角色，是免疫系统的关键“指挥官”。IFN-γ的生物学活性极为广泛，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种功效。

在抗病毒方面，IFN-γ可以诱导细胞进入抗病毒状态，就像给细胞穿上一层“防护铠甲”，让病毒难以入侵。例如在丙型肝炎病毒（HCV）的感染过程中，IFN-γ能够下调claudin-1的表达，而claudin-1是HCV病毒进入细胞所必需的受体，从而有效抑制病毒进入细胞。此外，它还能通过减少已进入受体的表达或阻止病毒向细胞质的细胞内转移，在细胞外阶段实现对多种病毒进入细胞的抑制。对于包膜病毒，IFN-γ诱导的溶酶体硫还原酶（GILT）还能有效地限制其脱落和传播。在抗击新型冠状病毒肺炎（COVID-19）中，IFN-γ作为可能预防和治疗的药物，已被证实具有早期预防以及治疗的能力，并可减少轻度病例发展为重症病例。它可以用不同的方式促进双链RNA反应，还能与其他干扰素（如IFNα和IFNβ）联合使用，增强抗病毒反应。

IFN-γ在抗肿瘤领域同样表现卓越。它不仅能直接作用于癌细胞，通过干扰素-γ信号通路及其下游靶基因抑制癌细胞生长，还能通过抗血管生成作用抑制肿瘤。IFN-γ可以诱导血管抑制趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的产生，阻断新生血管形成，切断肿瘤的营养供应，从而达到抑制肿瘤的目的。临床实验也发现IFN-γ能提高前列腺癌和黑色素瘤患者的生存率，特别是对2期和3期的卵巢癌有较好的治疗效果。德国MaxDelbrück分子医学中心的ThomasBlankenstein教授团队研究发现，γ干扰素可以作用于肿瘤里血管内皮细胞，促进肿瘤血管收缩，切断肿瘤能量供应，使肿瘤消褪。

在免疫调节方面，IFN-γ能激活巨噬细胞，使其吞噬能力大增，产生更多的活性氧物质，更高效地清除病原体；还能引导CD4+T细胞分化为Th1亚群，强化细胞免疫。同时，IFN-γ也参与M1巨噬细胞极化，抑制M2表型的形成，通过促进树突状细胞的成熟和增加MHCI和MHCII受体的表达来积极调节先天性免疫应答。通过T细胞活化，伴随着增加MHCI受体的多样性和数量来实现抗原的增强，并且IFN-γ通过上调中性粒细胞中PD-L1的表达和减少2型细胞因子的产生来下调2型免疫反应。

由于IFN-γ具有如此重要的生物学功能和临床应用价值，对其进行大规模生产以满足日益增长的医疗需求显得尤为迫切。目前，利用基因工程方法生产IFN-γ是主要的途径，其中又以大肠杆菌作为宿主菌进行生产最为常见。然而，在利用大肠杆菌表达外源基因生产人干扰素-γ的过程中，面临着诸多挑战。一方面，大肠杆菌表达外源基因时表达效率往往不高，导致人干扰素-γ的产量难以满足需求；另一方面，所表达的蛋白质多以包涵体的形式存在。干扰素类蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达较为普遍，包涵体是一种不溶性的蛋白质聚集体，为获得有活性的重组蛋白，需要经过复杂的后续处理过程，包括对包涵体进行洗涤、溶解以及不同浓度的尿素梯度复性，再经过柱纯化等步骤，这不仅大大增加了生产周期，也使得生产成本大幅提高。因此，如何提高重组可溶性人干扰素-γ工程菌的表达效率和可溶性蛋白的产量，优化工程菌的培养条件，成为当前亟待解决的关键问题。优化工程菌培养条件，对于降低生产成本、提高生产效率、推动人干扰素-γ在临床治疗中的广泛应用具有重要意义，也能为类似蛋白的生产提供宝贵的经验和技术支持。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过系统和科学的方法，对重组可溶性人干扰素-γ工程菌的培养条件进行全面优化，以提高其表达效率和纯度。具体而言，首先构建含有rhuIFN-γ基因的重组工程菌株，并对其稳定性和表达效率进行验证。接着，综合参考相关文献和已有实验数据，筛选出如温度、培养基成分、氮源、载体选择、细胞密度和诱导条件等可能影响rhuIFN-γ表达和纯度的关键因素。随后，运用正交实验等系统的研究方法，对这些关键因素进行逐一优化，深入探究最优培养条件。在确定最优培养条件后，测定rhuIFN-γ在不同培养条件下的表达效率和纯度，进行严谨的质量分析和比较，以明确最适合的培养条件。同时，对最优培养条件下的rhuIFN-γ进行全面的结构和活性分析，深入探究改变培养条件对蛋白分子的影响。