真核细胞的制备和逆转录.pptVIP

*******第1页，共25页，星期日，2025年，2月5日RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。RNA分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。第2页，共25页，星期日，2025年，2月5日RNA的种类、分布、功能第3页，共25页，星期日，2025年，2月5日一、实验目的和原理逆转录PCR（RT-PCR）是一种检测细胞及组织中特异性基因mRNA表达的实验室技术。在中心法则中，可以以mRNA为模板在逆转录酶的催化下合成cDNA。所获得的cDNA反映了结构基因的组成，可用于构建cDNA文库并进行基因的表达调控等研究。第4页，共25页，星期日，2025年，2月5日掌握真核细胞RNA提取方法掌握逆转录聚合酶链反应的基本原理、实验基本条件;熟悉PCR反应条件的优化和注意事项，PCR引物设计的基本原则，定量PCR的原理和用途。第5页，共25页，星期日，2025年，2月5日RT-PCR扩增目的基因原理首先，以细胞或组织中分离的总RNA中的mRNA为模板，加入特异性3’引物或多聚T锚定引物或随机引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA链；然后，以cDNA链为模板，由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。扩增特异的基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，以代表该基因的mRNA水平表达情况。第6页，共25页，星期日，2025年，2月5日第7页，共25页，星期日，2025年，2月5日真核细胞RNA提取方法RNA是一种极易降解的核酸分子，存在于细胞质和胞核中。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，使RNA从细胞中释放出来，同时亦使RNA分子从核糖体蛋白中解离下来，并抑制细胞释放出的核酸酶。十二烷基肌氨酸钠是一种离子型去污剂，能解离RNA上的核蛋白和抑制RNA酶活性，不容易析出沉淀。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA、核DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其它细胞组分分离出来，得到纯化的总RNA。Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。具有简便、经济和高效的优点。Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆等。第8页，共25页，星期日，2025年，2月5日分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。的成败很大程度上决定于RNA的质量。在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，RNA酶很稳定，一般而言反应不需辅助因子，RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，它耐热、耐酸、耐碱，蛋白质变性剂可使之暂时失活。RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起严重的后果。第9页，共25页，星期日，2025年，2月5日RNA分离的最关键因素是尽量避免RNA酶的污染。实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品都需特别处理。一方面避免外源RNase的污染。要做到如下几点：①操作戴口罩和手套；②实验室保持洁净；③玻璃器皿须用0.1%二乙基焦碳酸盐（DEPC）浸泡处理，并高压灭菌，250℃烘干4小时以上（高压不能完全灭活RNase）；④所有溶液（除Tris外）须经DEPC浸泡处理；⑤实验中所有塑料器材最好灭菌后一次性使用，所有化学试剂用新包装。另一方面排除内源RNase污染。内源RNase是由组织细胞中携带，细胞破碎后即释放出来。因而力争在提取的起始阶段对RNase活力进行有效抑制，主要方法是使用RNase抑制剂，常用的有盐酸胍、异硫氰酸胍、RNase阻抑蛋白（RNasin）和氧钒核糖核苷复合物等。所有分离提取RNA的方案的第一步操作都是在能导致RNA酶变性的化学环境中裂解细胞，然后才将RNA从各种生物大分子中分离出来。决定采用何种合适的制备方法，取决于RNA的细胞来源及其最终用途。本实验介绍从真核细胞中提取总RNA的通用方法，细胞用异硫氰酸胍裂解，此过程操作较少，从许多来源都能获得纯净的RNA，是从高内源性RNA酶的组织中提取RNA的首选方法。第10页，共25页，星期日，2025年，2月5日PCR技术的产生和发展:.1971年Khorana于最早提出核酸体外扩增的设想.1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明PCR技术.1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)