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构建乳杆菌多相鉴定体系：原理、步骤与应用探索

一、引言

1.1研究背景与意义

乳杆菌（Lactobacillus）作为乳酸菌的重要成员，是一类革兰氏阳性、无芽孢、厌氧或兼性厌氧的杆菌，在自然界中分布极为广泛，涵盖土壤、水体、植物、动物以及人体的口腔、肠道、阴道等诸多环境。在食品工业领域，乳杆菌堪称发酵的关键角色。以酸奶制造为例，德氏乳杆菌保加利亚亚种与嗜热链球菌相互协作，前者能够合成胞外蛋白酶降解原料中的蛋白，为嗜热链球菌提供生长所需的氨基酸及小肽类物质，而后者则提供甲酸盐及二氧化碳刺激前者的生长，共同发酵牛乳，不仅分解乳糖产生乳酸，赋予酸奶独特的酸味和醇厚口感，还将牛乳中的酪蛋白等营养物质转化为更易被人体吸收的形式，极大地缓解了亚洲人种普遍存在的乳糖不耐症，使得酸奶深受消费者喜爱。在泡菜加工中，乳酸菌利用蔬菜中的养料进行发酵，不仅显著提高了蔬菜制品的营养价值，还通过产生特殊的风味物质，改善了蔬菜制品的风味，同时抑制了有害微生物的生长，有效防止了泡菜的败坏。在发酵肉制品加工过程中，乳酸菌繁殖产酸，一方面将NO-2还原成NO，NO与肉中肌红蛋白结合赋予肉制品明亮的鲜红色，另一方面抑制杂菌生长繁殖，防止肉色变绿和脂肪氧化，还能延长发酵肉制品的货架期，降低亚硝酸盐含量，提高食用安全性。

在医疗保健领域，乳杆菌同样发挥着举足轻重的作用。罗伊氏乳杆菌对胃肠道环境具有出色的耐受能力，对人工胃液、肠液和胆盐都有一定的耐受性，并且对肠黏膜具有很强的黏附能力，可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病。它还能产生一种被称为“罗伊氏菌素(Reuterin)”的非蛋白质类广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长，其益生菌制剂可有效改善人体机能，提高免疫力。植物乳杆菌能够在肠道内大量存活，可以有效调节肠道内菌群平衡、促进人体消化吸收，还具有降胆固醇、预防心血管疾病、控制体重、增强人体免疫力等保健功能。

随着乳杆菌在各个领域的应用日益广泛，对其进行准确鉴定显得尤为重要。不同种类的乳杆菌在代谢途径、生理功能以及对环境的适应性等方面存在显著差异。在食品发酵中，若使用错误的乳杆菌菌株，可能导致发酵失败、食品风味不佳或保质期缩短等问题。在医疗保健领域，错误的鉴定可能会使益生菌产品的功效大打折扣，甚至对人体健康产生负面影响。传统的乳杆菌鉴定方法，如基于生理特性和生化反应的经典鉴定方法，操作繁琐、耗时费力，且实验结果的准确性易受多种因素干扰，已难以满足现代科研和生产的需求。因此，建立一套全面、准确、高效的乳杆菌多相鉴定体系具有重要的现实意义，它不仅有助于深入研究乳杆菌的生物学特性和功能，还能为其在工业、医疗保健等领域的合理应用提供坚实的技术支撑，推动相关产业的健康发展。

1.2乳杆菌多相鉴定体系的研究现状

乳杆菌的鉴定方法经历了从单一传统方法到多相鉴定体系的发展历程。早期，经典的鉴定方法主要基于乳杆菌的形态学特征、生理生化特性。在形态学观察上，通过显微镜查看乳杆菌的形状、大小、排列方式等，如德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体呈长杆状，单个或成链排列，两端钝圆。在生理生化特性检测中，涵盖了糖发酵实验、接触酶实验、氧化酶实验等多种项目。以糖发酵实验为例，不同乳杆菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖等糖类的发酵能力及产物各异，嗜酸乳杆菌能发酵多种糖类产酸，而有些乳杆菌对特定糖类则无法利用，这些差异可作为鉴定依据。但这些经典方法存在明显的局限性，一方面，操作流程繁琐，需要进行大量的实验和长时间的观察；另一方面，实验结果易受培养条件、菌株状态等因素影响，准确性欠佳，而且对于一些亲缘关系相近的菌株，难以准确区分。

随着分子生物学技术的飞速发展，基于核酸分析的鉴定方法逐渐兴起并广泛应用。16SrRNA基因序列分析是目前较为常用的分子鉴定方法之一。16SrRNA基因存在于所有细菌的基因组中，具有高度的保守性和特异性，其序列包含保守区和可变区，保守区反映了生物物种间的亲缘关系，可变区则体现了物种间的差异。通过对16SrRNA基因进行PCR扩增、测序，再与基因数据库中的已知序列进行比对分析，可确定菌株所属的属和种。在鉴定一株未知乳杆菌时，若其16SrRNA基因序列与数据库中植物乳杆菌的相似度达到99%以上，可初步判定该菌株为植物乳杆菌。不过，16SrRNA基因序列分析也存在一定的局限性，对于一些亲缘关系极近的乳杆菌物种，其16SrRNA基因序列差异较小，难以实现精准鉴定。

为了弥补16SrRNA基因序列分析的不足，一些其他基因序列分析方法也被应用于乳杆菌鉴定，如pheS基因和rpoA基因序列分析。pheS基因编码苯丙氨酰-tRNA合成酶，rpoA基因编码RNA聚