氧化应激损伤的生物化学诊断.pptVIP

二、一氧化氮与一氧化氮合酶的测定(一)一氧化氮(NO)测定NO含量少，且极不稳定,较难直接测定其含量。常用测定NO含量的方法多利用NO的化学性质，测定其终末产物NO3－和(或)NO2－的含量来反映组织细胞NO的含量。物理方法有微电极法和EPR法，优点是灵敏度较高，可实时检测，但需昂贵仪器限制了应用。化学方法有Griess试剂法、硝酸盐还原酶法、荧光分光光度法、催化光度法、化学发光法，其中以Griess试剂法最为常用。*第62页，共109页，星期日，2025年，2月5日1.Griess试剂法：A550与NO2－或NO的产量成正比，据此测定NO2－+对氨基苯磺酸重氮化合物pH7.5～8.1重氮化合物+N-(1-萘基)-乙二胺紫红色产物偶联550nm本法稍加修改即可用于测定样品中的总硝酸盐含量(NO3－与NO2－浓度之和)。(一)一氧化氮(NO)测定*第63页，共109页，星期日，2025年，2月5日加合物+N-(1-萘基)-乙二胺Griess反应NO3－NO2－铜离子活化镉NO2－+对氨基苯磺酸加合产物H+测A550nm，即可求出[NO2－]测NO3－时可将其先还原成NO2－，再测。因血清中[NO3－][NO2－]，[NO2－]很低，因而测定结果主要反映血清中NO3－的含量。*第64页，共109页，星期日，2025年，2月5日无需特殊的设备和昂贵试剂，操作简便迅速，在一般实验室、均可开展，是目前使用最普遍的方法，适用于大批量样品测定。本法测的是NO2－含量,属于间接测定NO量，其特异性较差。NO的还原可采用铜离子活化镉还原法或硝酸盐还原酶法。【方法学评价】*第65页，共109页，星期日，2025年，2月5日测定光子量，可代表组织细胞NO的含量。可用NO气体制作校正曲线，直接测定样品中的NO。2.化学发光法通过酸化或/和加入还原剂，使样品中的亚硝酸盐释放NONO+O3激发态NO2*发光返回基态样品用量较少，灵敏度较高，测定范围50～250pmolNaNO2易受样品中其他因素的干扰，测定的NO含量并不完全代表组织细胞实际的NO量。【方法学评价】*第66页，共109页，星期日，2025年，2月5日一般的Griess法仅测定NO2－或NO3－的含量，且Pr的NO衍生物均被脱蛋白的步骤除去。本法基于所有NO相关复合物均可被热裂解为硝酸盐。血浆Pr可通过热变性而除去，避免其干扰。3.全血NO代谢产物的测定血液中NO代谢产物除NO3－/NO2－外，还包括S-亚硝基血红蛋白，亚硝酰血红蛋白等S-亚硝基/亚硝酰化合物，其总称为NO代谢产物。*第67页，共109页，星期日，2025年，2月5日激发波长365nm，发射波长426nm条件下测荧光强度NO2－+2，3-二氨基萘1-(H)-萘三唑H+测定血中NO代谢产物总量，待测样品可为溶血或全血标本，测定结果可较全面反映NO代谢情况。其他方法因易受Hb或其他Pr影响，不宜用全血标本测定。【方法学评价】*第68页，共109页，星期日，2025年，2月5日(二)NOS测定1.化学发光法2.血红蛋白法3.NADP+检测法*第69页，共109页，星期日，2025年，2月5日1.化学发光法加入去铁乙胺可消除Hb对测定的干扰NO+L-瓜氨酸NOSO2·L-精氨酸+NO+H2O2ONOO－化学发光OH－鲁米诺加入SOD可消除O2对测定结果的影响·*第70页，共109页，星期日，2025年，2月5日2.血红蛋白法HbO2和MHb光谱特性有pH依赖性，pH7.7时：HbO2于401nm有最大光吸收MHb与HbO2混合液在411nm有等位光吸收峰测定A401和A411的变化可监测NO产量的变化，反映NOS