第17章分子生物学基本技术定稿.pptVIP

2.凝胶滞留法(gelretardationassay)◆又叫迁移率改变法(mobilityshiftassay)，是检测DNA结合蛋白的一种简单灵敏的方法。◆基本原理：蛋白质可与DNA形成复合物，在进行PAGE电泳检测时，这些复合物比游离的DNA慢很多形成一个滞后带。第30页，共59页，星期日，2025年，2月5日第二节聚合酶链反应(PCR)Section2PolymeraseChainReaction第31页，共59页，星期日，2025年，2月5日一、PCR基本原理◆是在热稳定DNA聚合酶催化下的体外DNA合成的循环反应。◆PCR反应体系：DNA模板、热稳定性DNA聚合酶、引物、四种dNTP和Mg2＋。◆PCR反应三个基本过程：(1)变性：利用高温(~95℃)使双链解开。(2)退火：在低温(25~65℃)下使引物与模板配对。(3)延伸：在~72℃利用热稳定DNA聚合酶催化DNA合成。第32页，共59页，星期日，2025年，2月5日模板DNA引物dNTPTaqDNAPol变性退火延伸PCR循环第33页，共59页，星期日，2025年，2月5日◆PCR反应三个基本过程可以不断循环，从而使体系内DNA的量呈指数增长。变性退火延伸变性退火延伸循环1循环2经过多轮PCR第34页，共59页，星期日，2025年，2月5日二、PCR反应试剂1.模板(1)模板DNA用量少，一般使用102~105拷贝(2)有一定的纯度要求(3)对模板的序列有一定了解2.引物◆引物为一段寡核苷酸序列。◆每条引物的典型浓度约0.1~0.5μmol/L第35页，共59页，星期日，2025年，2月5日◆引物设计一般原则：(1)为待扩增序列两端的已知序列(2)长度一般为18-30个寡核苷酸(3)G+C含量合理：40~60%，Tm＝4(G+C)＋2(A+T)(4)在3末端避免富含G或C(5)避免引物二聚体的形成(6)避免引物形成发夹结构(7)在5端可引入限制位点第36页，共59页，星期日，2025年，2月5日3.DNA聚合酶◆热稳定性DNA聚合酶，从嗜热菌可获得。◆聚合酶的选择以实验目的为依据常用热稳定性DNA聚合酶酶最佳温度(℃)外切酶活性保真度Taq75~805→3低Tfl70－低Pfu72~783→5高DeepVent70~803→5高Pwo60~653→5高◆聚合酶的浓度通常为2~2.5U/100μl。第37页，共59页，星期日，2025年，2月5日4.dNTP◆高浓度的dNTP对扩增反应具有抑制作用，甚至引起聚合酶的错配，一般将浓度控制在200μmol/L左右。5.Mg2＋◆Mg2＋浓度高会引起非特异性产物增加，Mg2＋浓度低，会使聚合酶活性降低，一般控制在0.5~2.5mmol/L第38页，共59页，星期日，2025年，2月5日6.pH缓冲体系◆标准PCR体系常使用10mmol/L的Tris-HCl(pH8.3-8.8)缓冲体系，反应时由于温度升高体系的pH值可回落至7.2左右。7.一价阳离子◆标准PCR体系常使用50mM的KCl，对于扩增500bp以上的片段有利，调整至70~100mmol/L时，对扩增较短片段有利。第39页，共59页，星期日，2025年，2月5日三、PCR循环1.标准PCR循环包括变性、退火和延伸三步：变性：94-96℃退火：55-65℃延伸：~72℃重复25~35次第40页，共59页，星期日，2025年，2月5日2.PCR循环效率◆与聚合酶活力直接相关：Nf＝N0(1+Y)nNf为n次循环后的扩增序列拷贝数N0为靶序列的起始拷贝数Y为扩增效率，n为循环数若Y＝100％，则：Nf＝N0·2n◆当靶序列拷贝数达1012时，聚合酶成为扩增限制性因素第41页，共59页，星期日，2025年，2月5日1.目的基因的克隆2.基因的体外突