第2章蛋白质测序分离及提纯.pptVIP

有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，应用同样的原理，由这一氨基酸含量的分析结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质量。例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，计算所得的最低相对分子质量是35200。用其他方法测得的Mr是69000，所以每分子牛血清清蛋白含有两个色氨酸残基。第29页，共50页，星期日，2025年，2月5日2.7.2蛋白质纯化总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶第30页，共50页，星期日，2025年，2月5日（一）利用溶解度差别的分离方法1.等电点沉淀和pH控制当蛋白质处于等电点pH值，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有斥力而趋向于凝聚而沉淀。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的理可以把蛋白质混合物分离开来。蛋白质混合物的分离纯化方法第31页，共50页，星期日，2025年，2月5日2.蛋白质的盐溶和盐析中性盐对蛋白质有明显的溶解度影响。在低浓度时，中性盐增加蛋白质的溶解度，这种现象称盐溶。盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。盐析：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。第32页，共50页，星期日，2025年，2月5日3.有机溶剂分级法有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。第33页，共50页，星期日，2025年，2月5日（二）根据分子大小不同的分离方法1.过滤与膜分离借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。第34页，共50页，星期日，2025年，2月5日2.离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。第35页，共50页，星期日，2025年，2月5日第1页，共50页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的理化性质紫外吸收：最大吸收峰为280nm两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法进行测定胶体性质沉淀反应：盐析、pI沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀变性、复性水解颜色反应第2页，共50页，星期日，2025年，2月5日2.6.1蛋白质的性质第3页，共50页，星期日，2025年，2月5日第4页，共50页，星期日，2025年，2月5日2.6.2蛋白质的胶体性质（一）胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀第5页，共50页，星期日，2025年，2月5日蛋白质溶液有胶体溶液的性质，如：扩散慢、易沉降、粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体。????蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。蛋白质是相对分子质量很大的生物分子,相对分子质量一般在10000～1000000之间或更大一些.+++++++++++++++++++++++++++第6页，共50页，星期日，2025年，2月5日第7页，共50页，