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PCR替代技术，RPA全攻略之疑难解答

胜创生物

:重组酶聚合扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR

的检测技术(由英国公司TwistDxInc开发)。以此为基础的TwistAmp®扩增产品，能

够在15分钟内进行常温下的单分子检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用

于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

RPA反应需要在怎样的温度下进行?

标准TwistAmp®试剂盒的运行温度在37°C-42°C之间。温度超过42°C会使酶的活性受到影

响。RPA反应在低于37°C的条件下也能进行，不过TwistAmp®试剂盒已经针对反应速度进行

了优化，不一定支持超出范围的温度条件。为了获得更好的效果，TwistDx公司推荐用户在

40°C下使用于逆转录试剂盒。

RPA反应能实现多重化么?

可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精

心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量(nmol)最

好不要太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。

另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增的探针、设备以及荧光团的兼容性。

RPA反应需要在特殊仪器上进行么?

不需要。对TwistAmp®基础试剂盒和nfo试剂盒而言，只要温度能控制在37-42°C之间就行。

进行实时的体系(如TwistAmp®exo试剂盒)，需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，

比如酶标仪或实时检测的热循环仪。

RPA反应能对模板进行定量么?

可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，

扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时

开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA

反应就会开始。

此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢

RPA的反应速度。

扩增产物能在琼脂糖凝胶上分析么?

可以，TwistAmp®基础反应、TwistAmp®nfo和TwistAmp®fpg都可以通过跑胶进行终点分析。

不过TwistAmp®exo不行，因为该系统里的外切酶会扩增子。

扩增反应能进行荧光终点分析么?

可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。

RPA支持生物素或荧光标记的寡核苷酸么?

支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没

有发现任何差异。

能用性实时RPA么?

可以。性可以在RPA反应中进行定量和。不过，这种可以结合任何双链

，会生成来自引物的假阳性信号。由于RPA扩增在常温下进行，这种噪音会比PCR严重

一些。此外，不推荐把性用于TwistAmp®exo体系，因为体系中的外切酶会在

反应过程中切割扩增产物。

RPA试剂能制成master-mix么?

可以。在进行检测时，可以把重悬缓冲液、引物和探针混合在一起，重悬冻干的RPA

pellets。然后将不同加入反应体系，最后用MgAc起始反应。在进行引物筛选时，可以

用重悬缓冲液、模板、探针和一个引物制成master-mix，将其分装到1.5ml小管再

分别加