DB45_T2138-2020_水体中诺如病毒的核酸检测方法实时荧光RT-PCR法_广西壮族自治区 conv.docxVIP

ICS 11.020

C51 DB45广西壮族自治区地方标准

DB45/T2138—2020

水体中诺如病毒的核酸检测方法实时荧光RT-PCR法

DB45/T2138—2020

前 言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区卫生健康委员会提出并宣贯。本标准由广西壮族自治区卫生技术标准委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区疾病预防控制中心。本标准主要起草人：刘巍、邓丽丽、谭冬梅、马宇燕、钟革、李秀桂。

水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光RT-PCR法

1 范围

本标准规定了水体中诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于广西区域内地表水、地下水、集中式供水、娱乐用水、污水等水体中基因Ⅰ组和基因

Ⅱ组诺如病毒的检测。

2 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

诺如病毒 Norovirus世界范围内引起急性胃肠炎暴发和散发的重要病原体。大多数诺如病毒引起的水源性暴发疫情是由

于饮用水或生活用水被污染所致。诺如病毒属于人类杯状病毒科的诺如病毒属，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径26nm～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺如病毒基因组是单股正链RNA，全长7.5kb～7.7kb，根据基因特征，诺如病毒被分为6个基因组（genogroup，ＧⅠ～ＧⅣ），ＧⅠ和ＧⅡ是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因组，ＧⅣ也可感染人，但很少被检出。

2.2

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4.1.2 2.5mol/L氯化镁（MgCl2）溶液，配制遵照附录A中的A.1执行。4.1.3 3％牛肉浸膏洗脱液，配制遵照附录A中的A.2执行。

4.1.4 16％PEG8000溶液，配制遵照附录A中的A.3执行。

4.1.5 0.2mol/L的Na2HPO4溶液，配制遵照附录A中的A.4执行。

4.1.6 1mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、RNA提取试剂盒、实时荧光RT-PCR试剂盒。4.1.7 引物和探针。工作浓度均为10μmol/L，-20℃保存，引物和探针序列见表1。

表1 实时荧光引物和探针序列表

基因组 引物/探针

JJV1F(上游引物)GⅠ JJV1R(下游引物)

JJV1P(探针)JJV2F(上游引物)

GⅡ COG2R(下游引物)

RING2(探针)

序列

5-GCCATGTTCCGITGGATG-35-TCCTTAGACGCCATCATCAT-3

5-FAM-TGTGGACAGGAGATCGCAATCTC-BHQ-35-CAAGAGTCAATGTTTAGGTGGATGAG-35-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3

5-FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ-3

4.2 耗材

包括以下物品：

——混合硝酸纤维素膜，孔径0.45μm；——快速定性滤纸；

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1L水样+过程控制病毒+氯化镁溶液

过滤

剪碎滤膜+牛肉浸膏洗脱液

振荡洗脱20～30min

上清液+PEG8000溶液

4℃静置2～3h

4℃，10000g离心5min

沉淀+200μLNaHPO

剧烈振荡5min至重悬沉淀

4℃，10000g离心5min，取上清

病毒浓缩液

病毒RNA提取

实时荧光RT-PCR

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8 实时荧光RT-PCR检测

8.1 病毒RNA提取

8.1.1 使用病毒RNA提取试剂盒进行RNA的提取，可根据仪器和试剂盒要求调整操作步骤。以诺如病毒阳性的粪便悬液样本或商品化的诺如病毒样本为核酸提取过程阳性对照，以双蒸水作为核酸提取过程阴性对照。

8.1.2 将病毒浓缩液加入预先装有560μL裂解液的1.5mL离心管中，混匀，室温放置10min，再加入560μL无水乙醇，混匀。

8.1.3 取650μL混合液加入到纯化柱上，8000g离心1min弃收集管中的离心液。

8.1.4 将1.5mL离心管中剩余的混合液全部加入到纯化柱的上，8000g离心1min，弃离心液。8.1.5 于纯化柱上加入510μL洗液1，8000g离心1min，弃离心液。

8.1.6 于纯化柱上加入510μL洗液2，13000g离心1min，弃离心液。8.1.7 更换新的收集管，13000g离心1min。

8.1.8 将纯化柱放置到干净的1.5mL离心管上，向柱中心加入35μLRNA洗脱液，室温放置5min。8.1.9 8000g离心1min，离心管收集到的液体即为RNA。

8.1.10 所用实验用具及溶液应无RNA酶，操作过