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基础学习实验醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离和;此实验共包括如下三个部分

第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测

第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳

第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定;第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测;Ezrin蛋白是食管癌细胞侵袭移动的重要蛋白；

活性与非活性状态的Ezrin蛋白与F-actin的结合能力不一样，对细胞形态有重要影响;甘露糖化修饰预测：;;双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置。

聚丙烯酰胺凝胶兼有电泳和分子筛的双重作用，分辨率高。

第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定

90000-150000

电泳的含义

带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。

上槽接正极，下槽接负极，电压50V，预电泳30分钟，然后将电压维持在200-300V，1-2小时；

醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。

在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。

蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。

40%Ampholine

分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等

2.

双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置。

加样：光面用铅笔标注，无光泽面距一端1.

用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。

目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。

以NGAL蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果

加样：光面用铅笔标注，无光泽面距一端1.;豆蔻酰化位点预测：;乙酰化位点预测：;磷酸化位点预测：;以NGAL蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果;电泳的含义

带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。

电泳的应用

1.分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等

2.分析某种物质的纯度及分子量;电泳的基本原理;待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。

电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离；缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。

电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。

支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。

缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。;血清蛋白醋酸纤维膜电泳;各种电泳技术在临床检测分析方面有重要的作用;+;醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。

醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。;实验操作及注意事项;染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。

定量：

取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4NNaOH4ml；

剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色洗出，约半小时；

用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。;6.计算：

光密度总和T＝A+α1+α2+β+γ

白蛋白％＝A/T×100%

α1球蛋白％＝α1/T×100%

α2球蛋白％＝α2/T×100%

β球蛋白％＝β/T×100%

γ球蛋白％＝γ/T×100%;临床意义;聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳;以聚丙烯酰胺作为支持物，两性载体电解质在支持物内形成稳定的pH梯度，当蛋白