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诱变处理
诱变剂的作用:①提高突变的频率②扩大产量变异的幅度③使产量变异朝着正突变或负突变移动物理诱变剂:射线如紫外线、X-射线、γ-射线,快中子化学诱变剂:碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯等。1.诱变剂的种类与选择
选择诱变剂的种类:在同样效果下,应选用最方便的因素;而在同样方便的情况下,则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中,尤以紫外线为最方便,而在化学诱变剂中,一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”,如NTG。简便有效的诱变方法:紫外线的照射最为方便。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反应的方法很多,实际工作时可参看有关书籍。
以诱变剂浓度和处理时间来表示。应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线,选择合适的剂量。合适剂量:能扩大变异幅度又能促使变异移向正变范围的剂量。最适剂量的选择:产量性状的育种中多倾向于低剂量(致死率在70-80%)2.诱变剂的剂量
单一因子处理:复合因子处理:两种以上因素先后使用同时使用单一因子重复使用3.诱变处理方式
4.后培养突变表型有一个表现延迟的过程,即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟),需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。方法:处理后细胞在液体培养基中培养几小时,让细胞繁殖5代,以得到纯的变异细胞。
①基本要求:照射波长:为253.7nm照射距离:15~30cm照射功率:15W处理时间:几秒至几十分钟致死率:70~80%菌液密度:细胞数106-108个/mL左右悬液深度:0.5~1.0cm厚操作环境:红灯下进行,电磁搅拌紫外线的诱变育种
②操作步骤a.菌液以3000r/min离心5min,弃上清,沉淀用无菌生理盐水再离心洗涤b.将菌液用无菌玻璃珠的三角瓶内摇匀,细胞数可达108个/mL左右,作为待处理菌悬液。c.分别取梯度105,106,107,108个细胞数/mL菌液4mL于9cm培养皿内,预热紫外灯10min,开启皿盖,无菌磁力搅拌照射10~50s。操作均避免白炽光,在红灯下进行,或用黑纸包住。
e.取未照射的菌液和照射菌液各0.5mL进行稀释分离,计数活菌细胞数。f.取照射菌液2mL于液体培养基中(300mL三角瓶内装30mL培养液),120r/min振荡培养4~6h。g.取中间培养液稀释分离、培养。h.挑取菌落进行筛选。i.计算致死率,正突变率,负突变率
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