目的基因的制备.pptxVIP

2025/7/141第五章目的基因的制备第一节目的基因的制备第二节目的基因的分离

一概述2025/7/142基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。目的基因确定其表达调控机制和生物学功能建立高效表达系统构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）体外进行必要的结构功能修饰输回细胞内改良生物体遗传性状，包括人体基因治疗

二什么是目的基因2025/7/143基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的基因。如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因、工业用酶等相关基因等。

一般来说，目的基因的制备战略分为两大类一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。

第一节目的基因的制备2025/7/14第一节目的基因的制备5直接法制备基因从基因组文库中钓取目的基因从cDNA文库中钓取目的基因通过PCR直接扩增出目的基因

限制性核酸内切酶酶切分离法限制性内切酶酶切分离法适于从简单基因组（如质粒和病毒）中分离目的基因。对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点，用适当的限制性内切酶切割，一次就可获得目的基因。

1.2化学法直接合成基因2025/7/147所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。1977年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。早期通过化学合成的部分基因基因人胰岛素转运RNA?-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素?-干扰素大小（bp）12654281162453合成年代197819791981198219821984基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶Ａ大小（bp）105777170385324375合成年代198519851985198519861987

1.2.1化学合成法的基本战略2025/7/148小片段粘接法：全基因合成有三种战略：克隆入合适的载体根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段混合退火T4-DNA连接酶连接

1.2.1.2补钉延长法2025/7/149混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段

1.2.1.3大片段酶促法2025/7/1410根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段01混合退火02T4-DNA连接酶连接03克隆入合适的载体04Klenow酶聚合05

三种方法各有利弊2025/7/1411化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%

1.2.2化学合成的单元操作2025/7/1412化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的

化学合成的单元操作2025/7/1413OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活缩合氧化脱取代基玻璃珠DMT：二甲氧基三苯甲基连接臂

1.2.3DNA化学合成的用途2025/7/1414修饰改造基因设计新型基因如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等合成天然基因如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等制备探针、引物、接头0201

第一节目的基因的制备2025/7/14第一节目的