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罕见Pk表型个体的血清学和分子生物学分析

该研究报道了中国一例Pk表型患者的血清学特征及分子机制，并发现了一个新的B3GALNT1基因突变。研究结果为罕见血型的分子诊断和临床输血提供了重要依据。试验结果如下：

一、结果

1、血型鉴定

患者ABO血型初步定为O型，其他血型为CcDEe，P1抗原阴性；次子ABO血型为B型，其他血型为CCDee，P1抗原阴性。ABO正反定型见表2。

表2患者及次子ABO血型鉴定结果

Table2?ABObloodtypeidentificationresultsofpatientandhissecondson

2、直接抗球蛋白试验

患者抗IgG·C3d、抗-IgG、抗-C3d及AB浆对照均为阴性。

3、意外抗体筛查与鉴定

患者血清与3个筛选细胞在盐水介质、间接抗球蛋白法中均呈阳性反应，在37℃水浴锅放置约15min后发生溶血现象。患者血浆与3个筛选细胞在盐水介质、间接抗球蛋白法及37℃水浴15min后均为阳性且未发生溶血现象。患者血清与10个谱细胞均呈阳性反应，凝集强度一致，在37℃水浴15min后发生溶血现象；血清用2-Me试剂处理后，盐水介质检测为±，IAT介质检测为阳性；血浆及经56℃灭活后的血清与所有谱细胞在盐水介质中呈阳性反应，在37℃水浴锅放置后未发生溶血现象（表3）。患者IgM抗体效价为32，2-Me处理血清后检测IgG抗体效价为4。患者次子血清中未检出意外抗体。

表3患者血清/血浆意外抗体鉴定结果

4、与p表型个体、抗-PP1Pk、抗-Pk反应

患者血清与p表型红细胞反应为阴性。患者及次子红细胞与p表型血清反应均发生溶血现象。用3人份混合新鲜O型P1阳性红细胞吸收p表型血浆后获得抗-Pk，此抗体与患者红细胞反应凝集强度为2+，与次子及多人份对照红细胞反应凝集强度为±。提示患者为Pk表型，体内存在抗-P。

5、B3GALNT1基因和A4GALT基因序列分析

对患者及次子B3GALNT1基因和A4GALT基因编码区进行测序分析，与GeneBank参考序列比较，发现患者B3GALNT1基因第5外显子存在c.239T＞A和c.433C＞T复合杂合突变，次子为c.433C＞T杂合突变，其他外显子均未检出突变。患者进一步的单倍体测序显示，c.239T＞A和c.433C＞T突变位于B3GALNT1基因的不同染色体上，结合家系分析显示患者GLOB等位基因发生了复合杂合突变，基因型为GLOB*01N.03等位基因和1个新的GLOB等位基因。新序列提交NCBI后分配的GenBank序列号为PP501118；父子A4GALT基因均存在c.903CG纯合突变。特征位点的测序结果见图1。

图1本研究测序结果

6、中国人群GLOB血型等位基因汇总

经检索相关文献，发现中国大陆已报道4例Pk表型，均已进行基因检测，其中2种新发突变提交NCBI，GeneBank序列号分别为MZ592924、ON129564，截至发稿前，NCBI尚未赋予等位基因名称。本研究基因突变情况与国内其他地区的比较见表4。

表4?GLOB血型等位基因

7、突变碱基对蛋白作用效应的影响

利用PROVEAN、SIFT和PolyPhen-2生物信息学软件预测p.Leu80Gln对蛋白功能的影响，其分值分别为-5.99、0.000、1.000，与对应的阈值相差较大，均可造成对蛋白的破坏作用；利用PROVEAN生物信息学软件预测p.Arg145Ter对蛋白功能的影响，其分值为-8.85，与对应的阈值相差较大，可造成对蛋白的破坏作用；两突变同时经MutationTaster数据库分析均提示致病；见表5。

表5生物信息软件分析结果

二、结论

B3GALNT1基因c.239TA（p.Leu80Gln）及c.433CT（p.Arg145Ter）复合杂合突变可能是造成Pk表型的原因之一，其中c.239TA突变未见报道。

三、讨论

红细胞P抗原（红细胞糖苷脂，Gb4Cer）是红细胞膜中最丰富的中性糖鞘脂，也是细小病毒B19和某些P菌毛大肠杆菌的细胞受体。Okajima等（2000年）证实B3GALNT1基因编码红细胞糖苷脂合酶（β3GalNAc-T1），该酶负责P抗原合成的最后一步，即将GalNAc（N-乙酰氨基半乳糖）转移至Pk抗原末端的Gal（半乳糖）上。

2002年Hellberg等通过对4例Pk表型样本（1例P1k，3例P2k）B3GALNT1基因的研究，发现2名P2k表型个体携带纯合无义突变（c.202T和538insA），导致提前终止密码子，截断酶活性域；一名P1k和一名P2k表型个体携带纯合错义突变（c.797AC和c.811GA），影响酶活性关键区域的电荷与结构，从而明确了GLOB系统中罕见的红细胞糖苷脂缺失表型（P1