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贴壁细胞培养步骤演讲人：日期:

目录CONTENTS01实验前准备02细胞复苏与接种03细胞传代操作04培养过程监控05细胞冻存流程06常见问题处理

01实验前准备

培养基配制与预热根据细胞生长需求和实验要求，选择合适种类和规格的培养基。培养基选择按照培养基配方准确称量各成分，溶解于适量蒸馏水中，调节pH值和渗透压。培养基配制将配制好的培养基放入恒温水浴锅中预热，使其温度与室温保持一致。培养基预热

实验器械灭菌处理6px6px6px使用清洁剂和纯水清洗实验器械，确保表面无残留物。器械清洗选择高压蒸汽灭菌法或其他合适的灭菌方法，确保灭菌效果。灭菌方法将清洗后的器械进行包装，以便进行灭菌处理。器械包装010302在灭菌后的器械上标明灭菌日期和有效期，并存放在无菌条件下备用。灭菌后处理04

超净工作台紫外消毒紫外灯预热工作台清洁紫外消毒时间消毒后处理提前开启紫外灯进行预热，确保紫外光强度稳定。使用消毒液擦拭超净工作台表面，确保无尘埃和杂质。将实验所需物品放入工作台内，关闭门窗，开启紫外灯进行消毒，时间通常为30分钟以上。关闭紫外灯，等待一段时间让臭氧消散后，再打开门窗通风，并取出实验物品进行下一步操作。

02细胞复苏与接种

准备工作确保水浴锅温度设定为37℃，准备好消毒过的离心管和培养基。冻存管快速复温操作快速复温将冻存管从液氮或冰箱中取出，立即放入37℃水浴锅中，轻轻摇晃，使其在1-2分钟内快速融化。转移细胞使用吸管将细胞悬液转移到离心管中，避免使用冻存管中的残留液体。

离心去除冻存保护剂将离心管放入离心机中，以适当速度离心5-10分钟，使细胞与冻存保护剂分离。离心操作小心去除上清液，避免带走细胞。去除上清必要时可重复离心一次，以确保完全去除冻存保护剂。重复离心

细胞悬液密度调整接种培养将调整好密度的细胞悬液接种到培养瓶或培养皿中，放入培养箱进行培养。03根据实验需要，使用培养基将细胞稀释至适宜密度。02稀释细胞细胞计数使用细胞计数板进行细胞计数，确定细胞密度。01

03细胞传代操作

消化时间与终止判断01消化时间使用胰酶等消化液对贴壁细胞进行消化，消化时间需根据细胞特性和消化液浓度进行调整，避免过度消化或消化不足。02终止判断消化完成后，需用完全培养基终止消化，并轻轻吹打细胞，使其分散成单个细胞。

细胞分离吹打技巧吹打细胞时，需用吸管轻轻吹打细胞悬液，避免细胞破裂或损伤。吹打力度分离方法吹打次数可采用差速贴壁法、离心分离法等方法将细胞与消化液分离，提高细胞分离效果。吹打次数不宜过多，以免对细胞造成损伤，影响细胞生长。

接种细胞时需根据细胞生长特性和培养瓶/板面积等因素，控制适当的接种密度，避免细胞过度密集或稀疏。分瓶接种比例控制接种密度对于传代培养，一般接种比例为1:2至1:5，以保证细胞在新的培养环境中能够良好生长。接种比例接种时需将细胞悬液均匀分散在培养瓶/板中，避免出现细胞聚集或分布不均的现象。接种均匀性

04培养过程监控

通过显微镜观察细胞形态，判断细胞是否健康，如细胞是否饱满、有无空泡等。细胞形态观察细胞分裂情况，判断细胞增殖状态。细胞分裂观察细胞是否聚集在一起，判断细胞间的相互作用及生长情况。细胞聚集显微镜下形态观察

污染迹象识别方法微生物污染发现培养液变浑浊、有异味，或细胞表面有小点、菌丝等微生物生长。01细胞形态异常细胞形态发生异常变化，如变形、裂解等。02培养基变化培养基颜色、透明度、pH值等发生异常变化。03

换液周期与时机根据细胞生长速度和培养液的营养成分确定换液周期，以保证细胞获得足够的营养。换液周期在细胞生长高峰期，细胞代谢旺盛，培养液中的营养物质消耗较快，需及时换液；在细胞生长缓慢期，换液频率可适当降低。同时，需根据培养液的颜色、透明度等判断是否需要换液。换液时机0102

05细胞冻存流程

冻存液配制方案选择适合细胞生长的基础培养基，如DMEM、RPMI-1640等。细胞培养基冻存保护剂血清常用的冻存保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）、甘油等，能有效防止细胞在冷冻过程中受损。根据细胞类型添加适量的血清，以提供细胞在冷冻过程中的营养支持。

程序降温操作规范降温速率采用程序降温仪，将装有细胞的冻存管以适当的速率降温至-80℃左右，再转入液氮罐中长期保存。温度监控避免反复冻融在降温过程中，需实时监控温度变化，确保降温速率符合细胞冻存要求。细胞在冻存过程中应避免反复冻融，以免对细胞造成损伤。123

液氮罐存储位置标记在液氮罐上明确标记细胞名称、冻存日期、细胞代数等信息，以便查找和管理。标记信息将液氮罐放置在安全、稳定的环境中，避免阳光直射和剧烈震动。存放位置定期检查液氮罐的存储情况，确保细胞处于良好的冻存状态。定期检查

06常见问题处理

检查培养基改善贴壁条件确保使用正确的培养基，并检查是否过期或变质。同时，检