第7章色谱分离技术.ppt

2亲和吸附剂的制备1.载体的选择①载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。②具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。③载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。④载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入⑤载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。第94页，共136页，星期日，2025年，2月5日1.载体的选择常用的亲和色谱载体主要有多孔玻璃载体、聚丙稀酰胺载体、纤维素载体、葡聚糖凝胶载体、琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶载体等。第95页，共136页，星期日，2025年，2月5日2.配基的选择根据配基应用和性质，可将其分为两类：特殊配基和通用配基。亲和层析中常用的特殊配基有某一抗原的抗体、某一酶的专用抑制剂、某一激素的受体等。通用配基可适用于一类物质的分离提纯，如用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基。第96页，共136页，星期日，2025年，2月5日5.稳定性树脂应有较好的化学稳定性，不容易分解破坏，不与酸、碱起作用。一般地说，阳离子交换树脂比阴离子交换树脂稳定性好。交联度小的稳定性好。树脂一般可反复使用上千次，稳定性仅成为此要的考虑因素。但含苯酚的硫酸型树脂及胺型树脂不易与强强碱长时间接触。第62页，共136页，星期日，2025年，2月5日6．膨胀性(膨胀度)干树脂浸在水溶液或有机溶剂中时，活性离子因热运动可在树脂空隙的一定距离内运动，同时由于存在着渗透压使外部水分渗入内部促使树脂空隙扩大而体积膨胀。测定膨胀前后树脂的体积比，可得出膨胀度。在设计离子交换罐时，树脂的装填系数应以工艺过程中膨胀度最大时的树脂体积为上限参数，以免装量过度或设备利用率降低。第63页，共136页，星期日，2025年，2月5日二、离子交换树脂的性质和种类三、离子交换树脂的选择依据离子交换交换色谱常用较细的树脂(50~100目)。但一般树脂的粒度较大，因此需要将树脂粉碎、过筛后使用，过筛分干法和湿法两种。干法较简单，但实际使用时粒度仍不均匀。利用水力浮选法，将树脂分级比较方便。改变水的流速就可得到不同粒度的树脂。第64页，共136页，星期日，2025年，2月5日三、离子交换树脂的选择依据树脂的骨架结构。目的分子的大小介质上带电功能基团功能基团的强弱第65页，共136页，星期日，2025年，2月5日四、流动相的选择依据离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对pH有一定缓冲能力的溶液。使用缓冲液可稳定流动相的pH，使之在层析过程中不致发生明显变化，同时还可以稳定目的分子上的电荷量，保证层析结果的重现性。要使目的分子带有电荷并以适当的强度结合到离子交换介质上，需要选择一合适的吸附pH。对于阴离子交换介质，吸附pH至少应高于目的分子等电点一个pH单位。第66页，共136页，星期日，2025年，2月5日四、流动相的选择依据吸附阶段应选择允许目的分子与介质结构达到最高的离子强度。而洗脱时要选择可使目的分子与介质解吸的最低离子强度。这就定出了洗脱液离子强度的剃度起止范围。在介质再生之前往往还需用第三种离子强度更高的缓冲液流洗柱床以彻底消除可能残留的牢固吸附杂质。在大部分情况下，吸附阶段溶液盐浓度至少应在10mmol/L以上。第67页，共136页，星期日，2025年，2月5日五、操作方法1.离子交换剂的处理2.装柱及上样装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一般为柱高的1/3)，加入树脂时使树脂借水的浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的pH、离子强度等。第68页，共136页，星期日，2025年，2月5日上样加压法是采用打气入柱的方式进行加压，可用一个装有样品的分液漏斗与柱用橡皮塞连接，分液漏斗上端串有压力剂并经缓冲瓶与打气管相连，当达到所需压力时就将打气管夹紧。减压法是在柱的排出口增设抽气装置，工业上多采用此法。第69页，共136页，星期日，2025年，2月5日3.洗脱分离不同的物质选用不同的洗脱剂。原则是用一种更活泼的离子把交换在树脂上的物质再交换出来。常用的洗脱剂为酸类、碱类或盐类溶液，改变整个系统的酸碱度和离子强度，以使交换物质的交换性能发生变化，己交换上的物质就逐渐被洗脱下来。为了提高分辨率，常采用剃度洗脱法。第70页，共136页，星期日，2025年，2月5日4凝胶色谱法凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种分离技术，又称之凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。它具有一系列的优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分离速度较慢。