牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化二_图文.pdfVIP

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牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠

杆菌中的融合表达和纯化（二）

5）金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性

在基因工程技术中，表达的重组蛋白多以包涵体形式存在，蛋白

质经常会错误折叠而丧失活性，这一难题长久以来都没有得到很好的

解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体，然后控制变性剂除去的速度，

有时需要添加适当的氧化/还原试剂，蛋白质可以逐步折叠复性。通常

使用的复性方法有三种，分别是稀释复性、透析复性和层析复性。

（1）稀释复性：直接把溶解的蛋白质稀释于复性缓冲液中。这种

方法操作简单，适于小规模使用，但只适于浓度极低的蛋白质复性，

否则会有大量聚集体形成。

（2）透析复性：采用透析膜通过逐渐降低外透液浓度来控制变性

剂去除速度。这种方法速度慢、耗时长，不适合大规模使用，有时易

形成无活性蛋白聚集体。

（3）层析复性：使蛋白质可逆吸附在固相介质上，例如离子交换

层析介质、金属螯合亲和层析介质等，可以避免伸展的多肽分子之间

形成聚集体。金属螯合亲和层析(IMAC)是一种有效的纯化和复性蛋白

质的层析方法。在高浓度变性剂存在的情况下，组氨酸尾仍旧具有吸

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附在金属螯合亲和层析介质上的能力，所以可在IMAC介质上同时实

现复性与纯化[112-116]。蛋白质吸附在IMAC介质后，先逐步降低变

性剂的浓度，使蛋白质折叠，然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗

脱出来。对于TNF蛋白，使用IMAC获得了90%的复性收率[73]。

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2.6小结

大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分

被人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统。在过去的20

多年中，用各种载体系统在大肠杆菌中表达了数百种重组蛋白。融合

标签不但可提高重组蛋白的产量，还可增强重组蛋白质的可溶性。融

合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。随着金属螯

合亲和层析技术的不断发展和改进，目前，固定化金属螯合亲和层析

技术已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工

具之一。

本课题组已成功构建了Pg菌毛蛋白fimA基因的原核表达质粒

pET-15b-fimA，本研究在此基础上，拟将此质粒在大肠杆菌

BL21(DE3)pLysS中表达，然后用固定化金属螯合亲和层析技术得到纯

化的FimA蛋白，为下一步获取免疫血清、进一步研制具有实用价值

的预防牙周炎的免疫疫苗提供实验基础。

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3实验一fimA在大肠杆菌中的表达

3.1实验材料与仪器

3.1.1菌珠

1）大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：北京天根生化科技有限公司。该

菌株基因型为：F-，ompT，hsdSB(rB-mB-)，dcm(DE3)，gal，pLysS，

Camr，该菌珠所带pLysS具有氯霉素抗性。此质粒含有表达T7溶菌

酶的基因，T7溶菌酶能降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG

诱导的表达。适于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。

2）携带有pET-15bVector和pET-15b-fimA的大肠杆菌TOP10（本

课题组前期实验获得）。其中pET-15bVector：原核表达载体，双链环

状DNA，由5708bp组成，含有可插入外源基因的多克隆位点（MCS）、

Amp抗性基因、T7lac、T7promoter、lacoperator、T7terminator、N-

末端His-Tag（6个组氨酸）。是一种组氨酸融合表达载体，这6个组

氨酸标签便于用钴柱纯化或以抗组氨酸抗体筛选。pET-15b载体读框