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科技成果——靶向型腺相关病毒载体的制备及应用

技术开发单位北京大学

适用范围临床基因治疗

成果简介

腺相关病毒（adenovirus-associatedvirus，AAV）作为一种备受关

注的基因治疗载体，由于具有病原性低和携带的治疗基因表达期长等

优势而成为目前最有前景的基因转移载体之一。然而，在临床基因治

疗过程中，AAV具有广泛的宿主范围同时也导致缺乏组织或细胞特异

性，对靶细胞的基因转染效率不高，同时也缺乏安全性。因此，提高

重组AAV（rAAV）的靶向能力对于基因治疗成功与否非常关键。

提高病毒靶向能力的一条重要途径就是在病毒衣壳表面偶联一

些靶向分子，带领病毒靶向特定组织、器官。所以，如何对AAV进

行无破坏的高效标记及靶向修饰，凸显的尤为重要。目前的载体改造

都是建立在靶向多肽的遗传插入或随机化学修饰基础之上的，但是尽

管极尽所能，我们还是很难克服一些AAV本身固有的一些限制，如

无法完全摒除病毒的天然嗜性、不能彻底解决修饰对病毒包装滴度的

影响等问题。因此，需要开发出新的具有位点特异性且不具有破坏性

的技术来修饰腺相关病毒。

近年来一直在从事蛋白质的非天然氨基酸定点标记技术的研究

工作，根据多年研究我们萌发了将该项技术应用在活病毒载体的定点

标记上的设想。该设想的实现将有可能解决活病毒难以任意定点无破

坏标记的世界性难题。由于病毒是由几十、甚至几百个蛋白包裹核酸

组成的复杂生命单元，对它实现无破坏标记的难度将大大超过对单个

蛋白的标记。该课题设想的难度大、不可控因素多，失败几率比较大。

我们将这一课题设想申请北京市自然科学基金预探索项目的支

持，并成功获得资助。在北京市自然科学基金的资助下，根据对AAV

晶体结构分析，选择14个标记位点，并在其中6个位点成功地标记

叠氮非天然氨基酸。利用该非天然氨基酸提供的叠氮基团，经点击化

学反应，定向偶联了靶向分子（cRGD），实现AAV靶向能力近30倍

的提高，进而成功建立了AAV的定点标记及靶向修饰新方法，并将

该方法申报PCT专利（定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方

法及应用，申请号：PCT/CN2014/089880。），目前已进入实质审查阶

段，预计明年能够获得授权。通过这种方法，能够对AAV实施任意

位点的定点叠氮标记和进一步无催化化学修饰，避免了以往研究中由

于对病毒衣壳大幅度或非特异修饰，而造成的病毒包装效率低、活性

差的后果，以及由于催化剂或剧烈化学反应对生物大分子造成的损伤。

同时，新偶联的靶向基团以较高的自由度游离于病毒衣壳之外，可屏

蔽病毒天然嗜性，展现新的靶向作用。总之，该方法为病毒的标记及

修饰提供了一种崭新的途径。

更进一步，为验证AAV靶向修饰的设想，我们首先将RGD（精

氨酰-甘氨酰-天冬氨酸）分子定点偶联在AAV表面，引导病毒靶向整

合素高表达的脑胶质瘤细胞，不但提高病毒的转导效率，病毒包裹

HSV-TK（单纯疱疹病毒胸苷激酶）自杀基因后，在细胞水平靶向杀伤

脑胶质瘤细胞的能力显著增强近30倍，使得脑胶质瘤的精准靶向治

疗成为可能。另外，通过偶联不同的靶头分子，可以使得AAV靶向

不同组织，制备出各类型的AAV靶向治疗载体、治疗药物等。AAV

定点标记及靶向修饰新方法的建立，极大的推动基于AAV的基因治

疗向更加安全、高效的方向迈出坚实一步，极有希望催生新一代的靶

向基因治疗药物。

效益分析

通过这种方法，能够对AAV实施任意位点的定点叠氮标记和进

一步无催化化学修饰，避免了以往研究中由于对病毒衣壳大幅度或非

特异修饰，而造成的病毒包装效率低、活性差的后果，以及由于催化

剂或剧烈化学反应对生物大分子造成的损伤。同时，新偶联的靶向基

团以较高的自由度游离于病毒衣壳之外，可屏蔽病毒天然嗜性，展现

新的靶向作用。总之，该方法为病毒的标记及修饰提供了一种崭新的

途径。