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DNA提取实验报告

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生物学大实验（二）

实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验

实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的

实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本

技术的理解和掌握。

实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、

摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌

器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳

仪、超净工作台等。

实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真

菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实

现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环

境恢复正常的时候不能够复性而质粒dna可以

复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分

离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制

性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位

点上，并切割dna。当对提取的质粒dna进行电

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10、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水

（ph8.0）中，储于-20℃冰箱中

三dna酶切反应

1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf管

（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入dna

（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液

2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶液，用手

指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一

下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败

的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时

应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于

适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃

水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。

3、每管加入2υl0.1mol/ledta

（ph8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存

备用。

四dna的琼脂糖凝胶电泳

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1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至

1000ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。

2、胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml

锥形瓶中，加入300ml0.5×tbe稀释缓冲液，

加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，

此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，

使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应

盖上封口膜，以减少水分蒸发。

3、胶版的制备：想冷却至50-60℃的琼脂

糖胶液中加入溴化乙锭（eb）溶液使其终浓度为

0.5υlg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固

不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待

胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝

胶，然后向槽内加入0.5υ×tbe稀释缓冲液至页

面恰好没过胶板上表面

4、加样：取20υl的酶解液与2υl10×载样

液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完

一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上

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样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的

凝胶刺穿

5、电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通

电源，控制电压保持在60-80v，电流在40ma以

上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2