GBT 35910-2018 猪圆环病毒2型阻断ELISA 抗体检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

中华人民共和国国家标准

GB/T35910—2018

猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法

Blockingenzyme-linkedimmunosorbentassayfordetectingtheantibodytoporcinecircovirustype2

06发布2018-02-2018-09-01实施

06发布

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T35910—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。

本标准起草单位：南京农业大学。

本标准起草人：姜平、王先炜、白娟、杨香林、刘捷。

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GB/T35910—2018

猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法

1范围

本标准规定了猪圆环病毒2型抗体阻断ELISA的检测方法。

本标准适用于猪圆环病毒病的抗体检测、疫苗免疫抗体监测和血清流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BSA:牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin)

ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)HRP:辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)

PCV2:猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2)TMB:四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine)

4仪器、材料与试剂

4.1试验仪器

4.1.1酶联免疫检测仪。

4.1.2高速台式冷冻离心机。

4.1.3微量移液器：规格0.5μL~10μL、20μL～200μL、100μL~1000pL。

4.1.412道可调微量移液器：规格10μL～100μL。

4.2试验材料

4.2.196孔酶标反应板。

4.2.2注射器(5mL)。

4.2.3微量离心管(1.5mL)。

4.2.4吸头(可与移液器配套)。

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GB/T35910—2018

4.3主要试剂

4.3.1PCV2重组核衣壳蛋白(Cap)抗原(见附录A)。

4.3.2辣根过氧化物酶(HRP)标记的PCV2单克隆抗体。

4.3.3PCV2阳性对照血清和阴性对照血清(见附录A)。

4.3.4四甲基联苯胺(TMB)(见附录B)。

4.3.5商品化PCV2ELISA抗体检测试剂盒。

5PCV2抗体阻断ELISA检测方法

5.1样品采集、运输与保存处理

5.1.1基本要求

按NY/T541采集猪血液，按SN/T2984处理待检猪。另外，按GB19489进行检测。

5.1.2样品采集与运送

采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL,凝固后24h内在冷藏条件下送到实验室。若不能及时送往实验室，则应分离血清，放人无菌微量离心管中置=20C保存，并在冻结状态下送往实验室。

5.1.3血清分离与保存

取凝固血液，2000rmm离心5min,集上清，放人无菌微量离心管中，立即用于抗体检测，或置-20℃保存。要求血清清亮，无溶血。

5.2ELISA操作步骤

5.2.1抗原包被板的制备

a)抗原包被：用抗原包被液(见B.1)将PCV2Cap蛋白(见A.D稀释成2.0μg/nL,加入96孔酶标反应板，每孔100μL,置37℃2h;

b)洗涤：倾去孔中液体，用PBST洗涤液(见B.5)洗涤，每孔300μL,洗涤3次，每次3min,最后一次拍干；

c)封闭：每孔加人200μL1%BSA(牛血清白蛋白)封闭液(见B.2),置37℃下孵育3h;

d)加保护剂：弃去孔申液