蛋白质的通性纯化和表征.pptVIP

（二）利用溶解度差别的分离方法影响蛋白质溶解度的主要因素：溶液的pH离子强度介电常数温度第31页,共58页，2024年2月25日，星期天蛋白质处于PI时，净电荷为零，相邻分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀1．等电点沉淀和PH控制不同蛋白质

∣

↓↓

等电点不同

∣

∣PI时溶解度最低

↓

将蛋白质彼此分开第32页,共58页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的盐溶和盐析中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响：盐溶——低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度在等电点时，中性盐K2SO4对一氧化碳血红蛋白的影响第33页,共58页，2024年2月25日，星期天作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。第34页,共58页，2024年2月25日，星期天原理－－大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析－－当离子强度增加到足够高时，如饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来，这种现象叫盐析。盐析法－－分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。（NH4)2SO4第35页,共58页，2024年2月25日，星期天血清半饱和硫酸铵离心球蛋白沉淀血清离心饱和硫酸铵白蛋白沉淀研究得最多的蛋白质之一——鸡蛋清的卵清蛋白就是用盐析法得到的：第36页,共58页，2024年2月25日，星期天3．有机溶解分级法如果：那么变性问题在很大程度上可以得到解决第37页,共58页，2024年2月25日，星期天作用原理：①.有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。②.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。

第38页,共58页，2024年2月25日，星期天4．温度对蛋白质溶解度的影响在40-50°C以上，大部分蛋白质变得不稳定,开始变性，一般在中性pH介质中失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质的操作一般在0°C或更低温度下进行。在0-40°C之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增大。第39页,共58页，2024年2月25日，星期天(三)根据电荷不同的分离纯化方法根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。1、电泳第40页,共58页，2024年2月25日，星期天第41页,共58页，2024年2月25日，星期天1)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。丙烯酰胺单体聚丙烯酰胺链N，N，N，N‘一四甲基乙二胺过硫酸铵交叉联接而形成凝胶N，N’一亚甲双丙烯酰胺调节单体的不同浓度不同程度交链结构第42页,共58页，2024年2月25日，星期天因此，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。那么如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率是不是就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。连续的——整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的不连续的——电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。在聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为：第43页,共58页，2024年2月25日，星期天1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂：十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用，当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别。这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。第44页,共58页，2024年2月25日，星期天2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）是一种阴离子去污剂，于100℃加热，在β-巯基乙醇存在下，可以使大多数多聚体蛋白质的四级结构解体，并与各亚基牢固地结合，从