5-葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质.pptVIP

*外水体积(Vo)：即凝胶柱中凝胶颗粒间自由空间的总体积，等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出外水体积Vo。内水体积（Vi）：为凝胶颗粒内部孔穴的总体积，可由m·WR求得（m为干凝胶质量，WR为凝胶吸水率）。*本实验中用SephadexG50（分离分子量范围1500~30000），以蒸馏水为洗脱剂（流动相）。分离蛋白A（黄色，分子量在G50的分离范围内）与蛋白B（蓝色，分子量大于G50的分离范围内）的混合物。凝胶柱层析

分离纯化蛋白质学习目的

了解：层析技术的基本原理;有效分配系数Kav的计算。理解：凝胶的选择和准备。掌握：凝胶层析的原理和操作方法;有效分配系数Kav的意义。重点：1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。2、分配系数与被分离分子量之间的关系。蛋白质的分离纯化蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。性质方法分子大小透析、超滤、密度梯度离心、凝胶层析等溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电荷电泳、离子交换层析等吸附性质吸附层析对配体分子的亲和力亲和层析凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。凝胶层析的基本原理凝胶：一些具有立体网状结构和一定孔径的高分子化合物。分子大于凝胶孔隙范围的物质：随着溶剂在凝胶颗粒间流动分子小于凝胶孔隙范围的物质：渗入凝胶颗粒的孔隙中凝胶层析的过程凝胶层析过程的数理关系凝胶干体积Vg外水体积Vo内水体积Vi柱床体积Vt=Vg+Vo+Vi洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积。凝胶层析的分配系数分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被凝胶排阻的程度。Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体积Ve有关：Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化，分离物分子量越大Kav值越小Kav=（Ve—Vo）/（Vt—Vo）葡聚糖凝胶柱层析法的特点天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶水的多孔网状高分子化合物。型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15

型号（G-X）分离范围（分子量）适用范围G255000脱盐、小肽等G-501,500~30,000低分子量蛋白、多肽G-753,000~70,000中、低分子量蛋白、多肽G1004,000~150,000中、高分子量蛋白G150~G2005,000~800,000高分子量蛋白Sephadex的常见规格（分级范围）X：①交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子量产品。反之亦然。②吸水量。G-25表示：1g干胶吸水2.5mL，依次类推。葡聚糖凝胶柱层析法的特点聚丙烯酰胺葡聚糖（Sephacryl）：烯丙基葡聚糖和N,N-亚甲双丙烯酰胺的交联共聚物型号：S-100,S-200,S-300,S-400等Sephacryl的常见规格（分级范围）预装柱车间现有规格1000~100000*外水体积(Vo)：即凝胶柱中凝胶颗粒间自由空间的总体积，等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出外水体积Vo。内水体积（Vi）：为凝胶颗粒内部孔穴的总体积，可由m·WR求得（m为干凝胶质量，WR为凝胶吸水率）。*本实验中用SephadexG50（分离分子量范围1500~30000），以蒸馏水为洗脱剂（流动相）。分离蛋白A（黄色，分子量在G50的分离范围内）与蛋白B（蓝色，分子量大于G50的分离范围内）的混合物。