DB34_T 3407-2019 猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA检测方法.docxVIP

ICS?11.220

B?41

DB34

安 徽 省 地 方 标 准

DB?34/T?3407—2019

猪流行性腹泻病毒?IgA?抗体间接?ELISA?检测

方法

Indirect?ELISA?to?detect?antidody?against?porcine?epidemic?diarrhea?virus

文稿版次选择

2019?-?11?-?04?发布 2019?-?12?-?04?实施

安徽省市场监督管理局 发?布

DB34/T?3407—2019

前 言

本标准按照?GB/T?1.1-2009?给出的规则起草。

本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。

本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省动

物卫生监督所、霍邱县动物卫生监督所、广德县畜牧兽医水产局、合肥市动物疫病预防与控制中心、含

山县畜牧局、怀宁县平山镇农业站。

本标准主要起草人：潘孝成、洪功飞、沈学怀、李雪松、王扬龙、赵瑞宏、张丹俊、戴银、胡晓苗、

侯宏艳、周学利、陈曦、陈福军、钱昌银、胡业和、程志清。

I

DB34/T?3407—2019

猪流行性腹泻病毒?IgA?抗体间接?ELISA?检测方法

1??范围

本标准规定了猪流行性腹泻病毒?IgA?抗体的间接?ELISA?检测方法。

本标准适用于猪流行性腹泻病毒?IgA?抗体检测。

2??缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine?Epidemic?Diarrhea?Virus）

ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked?Immunosorbent?Assay）

HRP：辣根过氧化物酶（Horseradish?Peroxidase）

OD：光密度（Optical?Density）

IgA：免疫球蛋白A（Immunoglobulin?A）

3??主要仪器

3.1??37℃培养箱。

3.2??酶联免疫检测仪。

3.3??酶联反应板

3.4??微量移液器（10?μL、100?μL、1000?μL）和吸头。

3.5??多道移液器（10?μL、100?μL、300?μL）

3.6??台式低温高速离心机

4??试剂和材料

4.1??PEDV?纯化浓缩抗原

/0.1??mL）接种??VERO??单层细胞，接毒后??72??小时收集病毒将第

/0.1??mL）接种??VERO??单层细胞，接毒后??72??小时收集病毒

7.35

培养物（含细胞和培养液），冻融?3?次，加入?1/10?体积的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，室温

振荡?10?min，6000?r/min?4℃高速离心?20?min，收集上清液；取上清液?45000?r/min?4℃超速离心?120

min。弃去上清液，沉淀用?0.01?mol/L?pH?为?7.4?的?PBS?充分溶解（PBS?使用量按原来病毒培养物体

积的?1/20），即为?PEDV?纯化浓缩抗原（测得蛋白浓度为?3.8?mg/mL）。

4.2??酶结合物

商品化的?HRP?标记的抗猪?IgA?抗体，工作浓度参照产品说明书。

4.3??标准阳性乳汁

PEDV?疫苗免疫健康猪制备，经琼扩法测抗体效价?≥1:64。

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4.4??标准阴性乳汁

未免疫?PEDV?疫苗且未感染?PEDV?的健康猪乳汁，经琼扩检测为阴性。

4.5??包被液

称取碳酸钠?1.0?g?和碳酸氢钠?3.0?g?溶于?1000?mL?去离子水，调节?pH?值至?9.4～9.6。

4.6??磷酸盐缓冲液

称取十二水合磷酸氢二钠?0.25?g、二水合磷酸二氢钠?3.5?g?和氯化钠?8.5?g，溶于?800?mL?去离

子水中，调节?pH?值至?7.2～7.6，用去离子水定容至?1000?mL。

4.7??封闭液

称取牛血清白蛋白?3.0?g，溶于?100?mL?磷酸盐缓冲液。

4.8??洗涤液

先配制?20?倍浓缩洗液，称取十二水合磷酸氢二钠?5.0?g、二水合磷酸二氢钠?70.0?g、氯化钠?170.0

g、吐温-20?16.0?mL，加去离子水?800?mL，调节?pH?值至?7.4～7.6，用去离子水定容至?1000?mL，121℃

15?min?高压灭菌后，室温存放备用。使用前，将?20?倍浓缩液用蒸馏水或去离子水按?1:19?的比例混

合即可。

4.9??稀释液

量取?5.0?mL?牛血清溶于?95.0?mL?磷酸盐缓冲液中。

4.10 底物液?A

称取?TMB?200.0?mg，无水乙醇（或二甲基亚砜）100?mL，加双蒸馏水至?1000?mL。

4.11 底物液?B

十二水合磷酸氢二钠?14.60?g、柠檬酸?9.33?g、