TALEN技术原理及应用.pptVIP

1.TALEN技术（Transcriptionactivator-likeeffectorsNucleases）是一种崭新的分子生物学工具。①1989年植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonasspp.）avrBs3基因被克隆出来。②2009年XanthomonasTA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译。由34个aa重复序列组成一个单元，重复17-18次，34个aa中的第12和13个氨基酸（RepeatVariantDi-residue,RVD),对应识别一个目标碱基。③迄今仅短短3年的时间，基于TALE结构的人工核酸内切酶已经被成功地应用于包括芽殖酵母（Saccharomycescerevisiae）、果蝇、斑马鱼（Daniorerio）、线虫（Caenorhabditiselegans）、大鼠（Rattusnorvegicus）、水稻（Oryzasativa）、蟋蟀（Gryllusbimaculatus）、家蚕（Bombyxmori）、非洲爪蟾（Xenopuslaevis）与热带爪蟾（Xenopustropicalis）、猪（Susscrofa）和牛（Bostaurus、拟南芥（Arabidopsisthaliana）在内的多个物种，以及体外培养的哺乳动物细胞（包括人类细胞）。④在2012年1月被NatureMethods杂志评选为2011年度最受瞩目、最有影响力的年度生命科学技术。⑤2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一。Science在评述中把TALEN称为基因组的“巡航导弹”，还大胆预测TALEN技术将成为所有分子生物学实验室都要掌握的基本实验技能。1.TALE靶点识别模块构建。TAL的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸。双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确。因此，欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元串联克隆即可。2.将（两个相邻）靶点识别模块（分别）克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对，靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。3.将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除TALEN质粒对共转入细胞后,表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与其特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI结构域形成二聚体,发挥非特异性内切酶活性,在两个靶位点之间剪切DNA,形成DSB（Double-StrandBreaks),诱发DNA损伤修复机制。TALENs产生的DSB能够通过以下两种途径进行修复:另一种是非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)修复，直接修复断裂的DNA双链，研究发现，该修复机制往往导致DNA断裂处碱基的突变，多数情况下发生碱基缺失．这种错误修复如果发生在一个基因的外显子上，能够导致该基因阅读框的改变，达到DNA定点敲除的目的。另一种是同源重组(homologousrecombination，HR)修复，在一个具有同源臂的DNA模板存在下，细胞能够将含有同源臂的外源基因整合到靶位点的DNA序列上，因此可进行knockin1.细胞可以通过NHEJ（Non-homologousEndJoining）修复DNA,在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基,造成移码,形成目标基因敲除突变体2.若在同原序列下,细胞通过同源重组(Homologousrecombination,HR)修复DNA科学家发现，来自植物细菌Xanthomonas（黄单胞杆菌）的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。TALE是由1.5~33.5个特异性识别DNA的串联“重复单元”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“重复单元”包含34个氨基酸，第12和13位aa残基是特异识别DNA碱基的关键位点，被称作重复可变双残基(RVDs)。NI(天冬酰胺-异亮氨酸)，NG(天冬酰胺-甘氨酸)，HD(组氨酸-天冬氨酸)，NN(天冬酰胺-天冬酰胺）。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。2.同时，无序列特异性的FokI核酸内切酶以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能。A.2011年，Bogdanove和Voytas描述了选择TALEN靶位点的原则：（1）TALEN靶位点5′端的