第六章-电泳技术2008.pptVIP

第六章核酸的电泳（electrophoresis）第一节、概述内容：1、基本原理、装置、影响因素和电泳种类。2、介绍琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶电泳，还有脉冲场电泳、变性梯度凝胶电泳、双向琼脂糖凝胶电泳和凝胶滞后实验等。1、电泳的基本原理概念：带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。原理：分子的性质：生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。电场性质：在同一电场的作用下，电荷性质、电荷数量以及分子量的不同的组分泳动的方向和速度也各异。结果：在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。电泳的迁移率在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E）。L是电极间距离。E=V/L电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷（q）与电场强度（E）的乘积：F＝qE在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F’）服从Stokes定律，即：F’=6πrηυr是球状分子的半径，η是介质粘度，υ是电泳速度电泳迁移率（u）公式当带电分子匀速移动时：F=F’，∴q?E=6πrηυ。则电泳速度：υ=qE/6πrη电泳迁移率（u）是指在单位电场强度时带电分子的迁移速度。也称淌度：u＝υ/E=q/6πrη由上式可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。2、电泳支持介质最初的滤纸和醋酸纤维素膜凝胶：淀粉凝胶，目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。介质（有交联孔径），导致电泳技术不仅可以利用分子的电荷特性，而且还可以利用分子的大小来达到分离目的。聚丙烯酰胺凝胶电泳3、电泳的装置水平电泳槽垂直电泳槽专利技术4、电泳的操作顺序移液器、枪头和分子量标记电泳结果图测序胶（大板胶）5、影晌电泳分离的主要因素1.待分离生物大分子的性质2.缓冲液的性质3.电场强度4.电渗5.支持介质的筛孔3.电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。4.电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动（支持介质表面可能会存在一些带电基团）；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。边缘效应，介质厚度。5.支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。

6、电泳的分类原理不同：⑴自由界面电泳：是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质。⑵区带电泳：各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带。⑶等速电泳：当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，并以等速向前运动，需使用专用电泳仪。“自身校正”效应。⑷等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。等速电泳先行离子（迁移率大）+样品+终止离子（迁移率小）。没有加入适当的支持电解质来载带电流，所得到的区带是相互连接的。u1〉u2，υ1〉υ2，若u2跟不上u1，则形成一个离子稀薄区。电阻变大。I＝E/R，I恒定。则E变大。u＝υ/E，υ2变大，跟上u1。示意图分类2按支持介质的不同可分为：

⑴纸电泳（Paperelectrophorisis）

⑵醋酸纤维薄膜电泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）

⑶琼脂糖凝胶电泳（AgaroseGelelectrophoresis）⑷聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelelectrophoresis）（PAGE）

⑸SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。按支持介质形状不同可分为：⑴薄层电泳；??⑵板电泳；??⑶柱电泳纸电泳示意图醋酸纤维薄膜电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速