植物基因的克隆原理与技术.pptVIP

利用λ噬菌体构建基因组文库第127页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三利用考斯质粒构建基因组文库第128页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三利用YAC构建基因组文库第129页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三cDNA文库cDNA文库(completementDNALibrary)：某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转录产生的各种cDNA片段，分别与载体重组而存在于一种受体的群体，即cDNA基因(部分)文库。第130页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三基因组文库包含该生物基因组DNA全部的序列；是具有生物种属特异性的。cDNA文库已经过剪接、去除了内含子的cDNA；具有组织细胞特异性。第131页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三cDNA文库的构建载体cDNA片段的制备分离细胞总RNA；以mRNA为模板，合成cDNA第一链；双链cDNA的合成。第132页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三mRNA纯化的方法：以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效。原理：利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱。第133页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三mRNA与oligo(dT)杂交而被吸附，其它RNA仍处于游离状态洗脱rRNA和tRNA收集洗脱下来的mRNA用纤维素柱纯化mRNA的流程示意图第134页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三第135页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三以已知序列为基础的克隆方法获取基因序列的途径：从文献中查取EMBL:设在欧洲分子生物学实验室的基因库网址:http://www.ebiac.uk/ebi-home.htmlGenbank:设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html第136页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三第137页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三第138页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三测序部分氨基酸序列简并引物部分cDNA作为探针基因组文库cDNA文库目的片段RACE-PCR目的片段部分RNA第139页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三RACE-PCR（末端快速扩增技术）使用此种方法的目的？在什么情况下用？基于什么技术（方法）？基本过程（基本原理）？第140页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三RACE（RapidamplificationofcDNAends）cDNA末端的快速扩增技术，是以mRNA为模板合成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5’端之间未知序列的方法。3’-RACERACE技术第141页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三5’-RACE第142页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法使用此种方法的目的？在什么情况下用？基于什么技术（方法）？基本过程（基本原理）？第143页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三定位克隆（图位克隆)以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法。原理：根据基因在图谱上的相对位置来进行基因克隆的一种方法。步骤：目的基因的定位构建分子标记的遗传图谱构建基因组文库基因克隆染色体步移or染色体登陆第144页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三染色体步移从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移。第145页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三基因组文库目的基因的旁序列作为探针基因组文库目的基因染色体步移功能鉴定第146页，讲稿共158页，2023年5月2日，星期三以人工突变体为基础的基因克隆方法转座子:是指基因组中一段特定DNA片段，能在转位酶的作用下从基因组的一个位点转移到另一个位点。原理：