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油樟油中主成分的抑菌活性研究 在我国食品产业中，对抗生素、黄瓜和其他添加剂的使用引起了人们的注意。天然产品中的食品添加剂已成为发展趋势。油樟[Cinnamomum longepaniculatum (Gamble) N.Chao ex H.W.Li], 为樟科 (Lauraceae) 樟属 (Cinnamomum) 植物, 中国特有种, 主产于四川省。在8种不同化学类型的油樟中, 1, 8-桉叶油素型油樟在主产地四川省有2万余公顷的栽培。夏明静等证实了主成分桉叶油素对痤疮丙酸杆菌具有强抑制作用。国内外研究还发现油樟油和其主要成分1, 8-桉叶油素对皮肤癣菌 (须毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样孢子菌) 和黄曲霉菌等真菌也有较好的抑菌效果。目前油樟油的抗菌活性研究主要集中在粗提取物方面, 而单体物质仅有1, 8-桉叶油素对皮肤癣菌的试验报道, 油樟油主成分 (1, 8-桉叶油素、松油烯-4-醇和γ-松油烯) 对常见病原菌沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌试验未见报道。为了充分利用与合理开发油樟资源, 本试验以油樟油中3种单体物质1, 8-桉叶油素、松油烯-4-醇和γ-松油烯为原料, 研究3种单体物质对常见病菌病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其对3株菌生长周期的影响, 为寻找新型抗菌药物或食品添加剂奠定基础。 1 材料和方法 1.1 菌株salmwellingraft 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ATCC 25923) 、埃希氏大肠杆菌 (Escherichia coli CMCC (B) 44102) 、沙门氏菌 (Salmonella enteritidis ATCC 50041) 标准菌株由四川农业大学食品科学院微生物实验室提供。MH肉汤培养基 (MellerHinton broth) 、营养琼脂培养基 (Nutrient agar) 、麦康凯培养基 (MacConkey agar) 、琼脂基础培养基 (Baird-Parker agarbase) 、SS琼脂培养基 (Salmomella Shigella agar) , 均购自北京奥博星生物技术有限公司。 1.2 植物材料 1, 8-桉叶油素 (99.5%) 、松油烯-4-醇 (99%) 和γ-松油烯 (99%) 由宜宾市江南香料有限公司惠赠。 1.3 除菌剂和培养基 1, 8-桉叶油素 (99.5%) 、松油烯-4-醇 (99%) 和γ-松油烯 (99%) 以吐温-80为乳化剂、以肉汤培养基为溶剂制成100μL/mL的母液, 用直径0.22μm的无菌滤器过滤除菌, 4℃冰箱保存, 临用前用灭菌的肉汤培养基稀释至50μL/mL。 1.4 菌株鉴定及培养 将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别接种到麦康凯培养基、SS琼脂培养基和Baird-Parker琼脂基础培养基平板上进行纯化, 分别挑取单个特征菌落接种于3mL灭菌MH肉汤培养基中, 置37℃恒温箱中过夜培养。取过夜培养后的菌悬液0.1mL加入到0.9mL的肉汤培养基 (或灭菌生理盐水) 中, 依次进行10倍比稀释, 选取适当的浓度涂板, 每个浓度3个平行, 选取菌落数在30~300之间进行计数, 用MH肉汤 (或灭菌生理盐水) 稀释菌悬液浓度至含菌体105~106cfu/mL后备用。 1.5 培养基抗菌活性测定 采用二倍稀释法分别将1, 8-桉叶油素 (99.5%) 、松油烯-4-醇 (99%) 、γ-松油烯 (99%) 配制成不同浓度的系列溶液, 以一系列无菌液作空白对照, 进行比色测定, 二者OD值相同即培养基中没有细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度。实验设3个对照, 肉汤培养基对照组、含2.5%吐温-80 (吐温-80的最高浓度为2.5%) 的菌液对照组和仅含供试菌的肉汤培养基对照组, 所有培养基pH均为7.2。 观察药物MIC以上未见细菌生长的各管培养物, 分别取0.1 mL移种至不含药物的营养琼脂平板上, 轻轻推开药液, 置于37℃恒温箱中过夜培养, 观察有无菌生长, 平皿培养基中, 无菌落生长者作为该药物的最低杀菌浓度。 1.6 挥发油单体抑菌能力的测定 根据抑菌试验所测得的3种单体对3种病原菌的MIC和MBC, 分别以0.5 (0.5倍MIC, 以下类推) 、1和2 MIC为浓度, 配制含3种单体的上述相应培养基, 再分别接种3种病原菌, 使其终浓度约为1×103cfu/mL, 充分混匀后置于37℃培养分别于培养后第0、2、4、8、12和24h取出菌液100μL按10倍顺序稀释, 选取适当浓度的菌液100μL接种于琼脂平板上, 用无菌玻璃刮铲将样品均匀涂布, 置于37℃恒温箱中培养, 选取平板上长有30~300个菌落计数。求两个平板平均菌落数, 根据稀