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基于is序列的小球藻鉴定 小球藻是优良的生物能源原材料，分布广泛，生长速度快，环境能力强，脂肪含量高。小球藻不仅可进行自养, 还可进行异养培养, 其种类繁多, 不同种对不同环境的适应能力相差大, 如不同小球藻能够存活的生长温度从26～42 ℃不等。对筛选的藻种进行分类鉴定, 再根据不同藻种的特点选择合适的培养条件, 对于小球藻的培养和油脂的生产具有重要意义。 传统的藻类种属鉴定以形态学手段为主, 主要是利用光学和电子显微镜对微藻细胞的细微结构进行观察描述。而小球藻细胞小、形态多样且细胞随着生理周期有一定的变化, 从而使得形态鉴定对从业人员要求很高。分子生物学鉴定是现代分类学的重要手段, 该方法具有快速、准确、数据可共享及易掌握的特点, 是对微藻形态学鉴定有效的补充和验证。分子鉴定方法多样, 如随机引物扩增片段多态性 (RAPD) 和简单序列重复区间扩增多态性 (ISSR) 等方法, 基因鉴定是其中一种简单、快速的鉴定方法, 广泛应用于物种鉴定和进化树发生、进化分析等研究, 在昆虫、鸟类、哺乳动物和一些植物中得到广泛应用, 但在藻类中相关研究较少, 多集中在硅藻和红藻研究。用于基因分子鉴定的基因片段种类多, 细胞色素氧化酶基因 I (Cytochromo Oxidase I,CoxI) 在动物分子分类中研究很多, 但并不适用于高等植物和绿藻的分类研究。核基因组中的核糖核酸小亚基基因 (18S rRNA gene, 18S) 、转录间隔序列区 (Internal Transcribed Spacers, ITS) 和转录间隔序列区2 (Internal Transcribed Spacers 2, ITS-2) 是研究的几个热门基因, 被广泛应用于药用植物、衣藻、硅藻和栅藻等藻类的分类研究。叶绿体基因核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因 (Large Subunit of Ribulose-1, 5- bisphosphate carboxylase oxygenase,rbcL) 被用于植物和藻类的分类研究。藻类分子鉴定相对于动物和一些植物的发展较为缓慢, 至今尚未找到通用的鉴定基因, 且无鉴定标准。为此, 笔者在借鉴已有的关于高等植物和藻类鉴定基因研究的基础上, 选用分子鉴定常用的4条基因, 经过系列试验从中选出了1种或几种最为适用的小球藻鉴定基因, 并通过试验分析划分出了种属遗传距离界限, 旨在为建立藻类的鉴定基因库提供参考。 1 材料和方法 1.1 接种量、时间 试验中所有淡水藻的培养均采用BG-11培养基, 指数生长期的藻种液以20%的接种量接种, 培养光照强度为10 000 lx, 光、暗周期为14∶10 h。采集对数期的藻细胞, 离心, 冷冻干燥备用。 1.2 方法 1.2.1 藻细胞油脂提取 将长势优良的藻种以20%的接种量接种于柱式反应器 (300 ml培养基) , 每组试验设置3个平行样品置光照培养箱中同期培养, 通入的气体为含3%CO2的空气。培养末期, 收集藻细胞 (5 000 r/min, 5 min) , 称重法提取藻细胞油脂, 计算油脂含量。称重法:生长进入平稳期后离心收集藻细胞, 冷冻干燥称重。称重法提取干细胞油脂, 气相色谱分析脂肪酸组分。称重法测定油脂含量:螺旋盖管中加干藻粉50 mg, 每个样品3次重复, 加入氯仿4.0 ml、甲醇2.0 ml, 旋紧螺盖, 蜗旋振荡10 s后置于摇床中200 r/min振荡12 h。3 500 r/min离心10 min, 移上清置锥底离心管中, 加甲醇2.0 ml、蒸馏水3.6 ml。3 500 r/min离心5 min, 取下层氯仿层置于预先称重的新螺旋盖管中, 氮吹仪吹干 (60 ℃, 20～30 min) 后置于真空烘箱中60 ℃干燥2.5 h, 称重记录。 1.2.2 从dns中提取数据 取30 mg冻干藻粉, 采用CTAB法进行藻细胞基因组DNA提取。 1.2.3 整合型企业分子pcr 试验引物 (表1) 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 反应体系 (总体积50.0 μl) 为:模板DNA 1.0 μl, dNTP (10 mmol/L) 1.0 μl, 引物 (10.0 μmol/L) 各1.0 μl, 10×PCR Buffer 5.0 μl,TaqPolymerase (5 U/μl) 0.5 μl, 超纯水40.5 μl。ITS基因片段的PCR扩增程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。将PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳, 在凝胶成像仪上观察结果。ITS-2基因的PCR扩增条件除退火温度为56 ℃外,