化妆品舒缓功效测试方法——PolyI：C和LPS诱导3D表皮模型的炎症因子(IL-8)体外测试方法.pdfVIP

化妆品舒缓功效测试方法——PolyI:C和LPS诱导3D表皮模型 的炎症因子(IL-8)体外测试方法 1 范围 本文件规定了一种化妆品舒缓功效的体外测试方法。 本文件适用于采用于体外重组三维表皮模型炎症因子IL-8体外测试试验评价化妆品及原料的舒缓 功效。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语及定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 三维表皮皮肤模型 3D epidermal model 三维表皮皮肤模型是以人皮肤组织分离出的角质形成细胞为种子细胞，使用精细调节的无血清培 养基促使细胞在体外发育成复层化结构的三维表皮模型。其具有高度类似于天然皮肤的复层化结构、 屏障功能。 3.2 炎症因子 IL-8 IL-8属于白介素家族的一种促炎因子，是湿疹发生过程中角质形成细胞释放的特异性促炎因子， 角质形成细胞释放IL-8后进一步会激活T细胞介导的特异性免疫反应，从而诱导红斑瘙痒等不适症状 的出现。 3.3 酶联免疫吸附测定 enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA 一种将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的高灵敏度分析技术。原 理是通过酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记抗体，该酶标抗体可与待测的抗原或抗体免疫 吸附结合，酶所催化的呈色反应可以间接反映抗原的量。 4 试验原理 采用PolyI:C和LPS联合诱导体外重组三维表皮模型，使其释放特异性的炎症因子IL-8 ，IL-8释放 后会进一步激活特异性免疫反应，进而介导炎症的级联放大，最终出现红斑瘙痒等不适症状。而抑制 IL-8释放的化妆品可以达到舒缓瘙痒红斑等不适症状的作用。采用IL-8酶标抗体的酶标板测定450nm波 长下测定吸光度（OD值）得到IL-8含量，受试物组与阴性对照组比较来计算IL-8抑制率。通过测试受 试物对IL-8抑制率情况，来评价样品的舒缓功效。 5 试剂和材料 5.1 体外重组 3D 表皮模型（EpiKutis® ）。 5.2 体外重组 3D 表皮模型培养液（EpiGrowth 培养液）。 5.3 IL-8 ELISA检测试剂盒或其他IL-8细胞因子检测试剂。 5.4 PolyI:C （Sigma）。 5.5 LPS （Sigma）。 5.6 地塞米松（Sigma） 5.7 磷酸盐缓冲液（PBS ）：pH 7.2~ pH 7.4 。 6 仪器 6.1 分析天平：分度值为0.0001 g 。 6.2 二氧化碳培养箱：37℃±1℃，（5±1 ）%CO ，95%相对湿度。 2 6.3 可调节移液器：1000 μL、200 μL、300 μL多道移液器。 6.4 超净工作台。 6.5 离心机。 6.6 倒置显微镜。 6.7 细胞板振荡器。 6.8 酶标仪。 6.9 水平振荡仪。 6.10 恒温培养箱 7 试验步骤 7.1 前处理 7.1.1 受试物准备 水溶受试物直接采用培养液作为溶剂。水难溶的受试物使用二甲基亚砜（DMSO ）作为溶剂。其 余溶剂需在使用溶剂前。必须仔细评估受试物的特殊性质，是否与受试物发生反应。 可以使用涡旋混合/或超声处理和/或加热到适当温度等方法辅助溶解，除非这些操作会影响到受 试物的稳定性。 除有稳定性数据证明储备液可接受，受试物均使用前新鲜配置直接使用。 如果受试物无毒，原液表面给药；受试物毒性有毒，则根据毒性预试验选择的无毒剂量浓度进行 表面给药。 7.1.2 刺激物准备 采用PolyI:C 和LPS 联合刺激，其中PolyI:C 的推荐使用浓度为60μg/mL ，LPS 的推荐使用浓度为 20μg/mL ，二者混合后加到模型培养液中配置成诱导工作液。 试验可接受质量标准为：与空白对照组相比，刺激物作用下阴性/溶剂对照组的IL-8含量显著性增 加（具有统计学差异 P0.05 ）。 7.1.3 阳性对照 每一次试验都应同时使用阳性对照进行试验。例如地塞米松，给药浓度为100 μg/mL 。试验可接 受标准为：与阴性对照组相比，阳性对照组IL-8 的分泌量显著性降低（具有统计学差异 P0.05 ）。 7.2 正式试验 7.2.1 试验分组 试验需设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和受试物组，每组3个模型，根据实验分组准 备6孔板并做分