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响应面法优化茶叶黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究 茶是科茶园的科植物。茶叶不仅具有提神清热、消食化痰、解毒醒酒、降火止痢等药理作用, 现代研究表明茶叶还具有降血糖、降低胆固醇、抗衰老、抗菌、抗病毒、防癌等多种生理功能。绿茶中的多种黄酮类物质具有特殊的生物效能, 对人类健康有重要作用, 它可以起到单重态氧清除剂的作用, 并对过敏、感染、高血压、肿瘤和AIDS等疾病具有辅助治疗作用。 黄酮物质具有清除体内自由基、防癌、预防心血管疾病等生物活性功能, 常用于保健品和药品, 替代合成抗氧化剂;氧自由基是引起人体衰老、细胞损伤某些疾病发生的主要原因之一。目前常用的食品抗氧化剂 (如BHT、BHA) 大多是合成品, 会引发食品安全性问题。天然抗氧化剂具有安全、无毒等优点。 本文利用废弃的粗老绿茶研究了茶叶黄酮在聚乙二醇/盐双水相体系中的分配行为, 通过单因素试验和响应面法, 探讨了聚乙二醇和盐的种类及用量, 温度、p H等对双水相系统及茶叶黄酮萃取率的影响, 优化工艺条件;所得黄酮再研究其抗氧化活性, 旨在为茶叶黄酮抗氧化功能的开发、利用以及食品的贮藏保鲜提供技术依据。 1 材料和设备 1.1 仪器、试剂和仪器 茶叶采用温州的粗老绿茶;2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚 (BHT) 、二苯基苦味酰基苯肼 (DPPH·) :美国Sigma公司;聚乙二醇 (PEG) (不同分子量) 及其他试剂购于国药集团, 均为分析纯。紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限公司;KQ-300VDV型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;RE52CS旋转蒸发仪:上海亚龙生化仪器厂;Scientz-10N冷冻干燥机:宁波新芝生物科技股份有限公司。 1.2 测试方法 1.2.1 标准曲线的绘制 1.2.2 超声提取法 将茶叶洗净、干燥、粉碎得茶叶末, 称取一定质量的茶叶 (1 g) , 在超声波功率280 W, 温度50℃下浸提, 乙醇体积分数50%, 料液比1∶20, 超声提取20 min, 直至浸提完全, 将浸提液加入到1 000 mL的容量瓶中, 定容, 得浸提液。以50%乙醇为参照液于波长273 nm处测其吸光度值得其质量浓度0.0442 mg/m L。 1.2.3 黄酮含量的测定 在刻度具塞离心管中加入一定质量的PEG、盐、浸提液、蒸馏水, 溶解, 形成双水相体系。所得体系PEG富集于上相, 下相为水相。上相为亮黄色, 大部分黄酮类物质分布于此, 下相为深黄色, 多数杂质和色素分布于此, 分别测定上、下相体积, 然后用紫外分光光度计于波长273 nm处测其吸光度值, 求得双水相中茶叶黄酮的含量。 R=Vt/Vb, K=Ct/Cb, Y= (1+1/RK)-1×100% 式中:R为相比;Vt、Vb为上、下相体积 (m L) ;K为茶叶中黄酮的分配系数;Ct、Cb为上、下相茶叶中黄酮的质量浓度 (mg/m L) ;Y为得率 (%) 。 1.2.4 peg用量的测定 在双水相中, 影响茶叶黄酮分配的因素有很多。量取1 mL茶叶浸提液, 以pH=9, 在30℃水浴中提取20 min为基准, 分别考察PEG不同分子量及其不同量、组成双水相不同盐及其不同质量分数、p H、温度及氯化镁的添加量, 以茶叶黄酮在双水相的上相中的得率为指标, 以确定影响较大的因素, 每组试验重复3次, 取平均值作图。 1.2.5 响应面优化试验设计 根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理, 综合单因素试验结果, 选取对茶叶黄酮在双水相中分配行为影响较大的3个因素, 采用3因素3水平的响应面分析方法进行试验设计, 以茶叶黄酮在上相中的得率为响应值, 每组试验重复3次, 取平均值, 运用SAS数据处理软件进行响应面分析, 对反应条件进行优化。试验因素和水平见表1。 1.2.6 dpph清除活性测定 茶叶黄酮的还原能力:2.5 mL不同浓度样品与2.5 mL 0.2 mol/L磷酸钠缓冲液 (pH6.6) 和2.5 mL 1%铁氰化钾混合, 50℃保温20 min, 加入2.5 mL 10%三氯乙酸, 混和物离心10 min (3 000 r/min) , 上清液 (5 mL) 加5 mL去离子水, 再加1 mL 0.1%三氯化铁混合, 静止10 min后在波长700 nm处测吸光度。其吸光度的大小即反映了其还原能力的大小;用BHT和Vc作比较。 茶叶黄酮对DPPH清除力的测定:DPPH分析法被广泛用于清除自由基物质性质的研究。DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基, 当有清除剂存在时, 其孤电子被配对, 吸光度下降或减弱。通过测定吸收减弱的程度, 可评价自由基清除剂的活性。取一定浓度的样品溶液2 mL, 加入2 mL用乙醇配制的0.8 mmol/mLDPPH溶液, 用力振摇混匀后置暗