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细菌双杂交系统的研究进展 近年来，微生物基因组的科学研究取得了迅速进展。根据美国基因组研究所（tigr）的报告，缩短了241种微生物的研究序列，并开展了9种微生物的研究。这些基因组信息揭示了大量的未知功能的开放读码框, 因此探寻一种研究这些基因功能的有效方法和确定其编码产物在行使其生物学功能过程中相互作用便成为了功能基因组学 (Functional genomics) 的主要课题。 早在10多年前, Chien CT便成功地将一种用于体内研究的遗传学方法应用于检测蛋白质之间的相互作用, 进而开发出了一种用于体内研究蛋白质之间相互作用的酵母双杂交系统 (Yeast two-hybrid system, Y2HS) 。随后该技术得到了不断的完善、扩展和多样化, 并在筛选与特定蛋白相互作用的靶蛋白、已知蛋白之间的相互作用结构域作图以及基因组范围的蛋白质关联谱的描绘等方面得到了广泛的应用。酵母双杂交系统的成功极大地刺激了与其类似方法的发展。1998年Dove SL和Hochschild A在E.coli中成功地建立了细菌双杂交系统 (Bacterial two-hybrid system, B2HS) , 从而极大地丰富了蛋白质相互作用的研究手段。 本文主要从细菌双杂交系统的原理与分类, 在病原微生物学中的应用及其优缺点等方面进行综述。 1 细菌双交系统的原理和分类 1.1 根据实验过程中产生的细菌双杂交系统 1.1.1 ranp的基因序列分析,即“引导”与“靶”的相互融合,并激活“靶”与“化合物1-3-基-5-羟基-4-甲基-5-靶-5-羟基-4-ranp的相互作用,激活报告基因,激活报告基因,激活报告基因,激活报告基因,激活报告基因,激活报告基因,激活ranp的转录 在E.coli中, 如果相互作用的蛋白一个通过DNA结合域与DNA结合, 另外一个与细菌RNAP的亚单位结合, 那么只要其相互作用具有足够的强度便能够激活转录。因此, 如果把“诱饵 (Bait) ”与序列特异性的DNA结合蛋白融合, 而把“靶 (prey) ”与细菌RNAP的一个亚单位融合, 那么“诱饵”与“靶”的相互作用便可以在启动子处征募RANP并稳固其结合, 激活报告基因 (Reporter gene) 的转录 (图1) 。在该系统中, DNA结合蛋白通常为λ噬菌体抑制剂 (λcI) , 而RANP亚单位一般为α, 报告基因可以是编码β内酰氨酶的bla和β半乳糖苷酶lacZ基因, 也可以是参与组氨酸生物合成途径的HIS3基因和链霉素抗性基因aadA, 但是后者具有筛选更大文库的能力 (~108以上) 和更低的假阳性率 (~3×10-8)。 1.1.2 toxr蛋白的激活和激活 霍乱弧菌转录调控剂ToxR蛋白是一种整合膜蛋白, 由位于胞浆的N末端DNA结合域 (DNA binding domain, DBD) 、一次跨膜片段 (TM) 以及周浆C末端域组成。在异源宿主E.coli中ToxR蛋白能以二聚体依赖的方式激活位于ctx操纵子的基因转录, 并且这种依赖只取决于DBD, DBD的wHTH基序为其结合DNA和激活转录的最低需要。当用异源蛋白组件或者TM片段取代ToxR的周浆域和TM片段时, 可用于在周浆中研究蛋白质的相互作用 (图2 A) 以及在自然膜环境下TM片段之间的相互作用;当使用缺乏TM片段的ToxR蛋白变体时, ToxR蛋白也可以用于在胞浆区室中蛋白质之间相互作用的研究 (图2 B)。嵌合蛋白之间的相互作用可以激活与ctx启动子融合的报告基因 (如:lacZ和catZ基因) 。 1.2 通过转让限制和细菌混合系统 1.2.1 i的低二聚化转录抑制剂 λ噬菌体抑制剂 (λcI) 是一种控制λ噬菌体溶菌/溶原周期转变的转录抑制剂。当与λ操纵子结合时, λcI可阻止参与溶菌程序的基因表达, 并且可以使λDNA整合入E.coli染色体使λ噬菌体进入溶原周期。λcI是由一条236个氨基酸组成的多肽链二聚化而成。每条链包括结合DNA的N末端域 (DBD) 和决定二聚化的C末端域 (DD) 。λcI只有在二聚化的形式下才能作为一种转录抑制剂, 缺乏二聚化能力的DBD不能单独抑制转录, 然而当其分别与可以相互作用的多肽或者蛋白质融合时 (图3) , 便可以发挥转录抑制作用。因此, 多肽或者蛋白质的相互作用可以通过与λ启动子-操纵子融合的报告基因表达的抑制或者细菌对噬菌体的敏感性而得到检测。但是该系统有很明显的缺点: ① DBD本身具有低二聚化的能力, 可单独显示组成性的低转录抑制活性; ②该系统不能用于筛选具有二聚化能力的“靶”蛋白, 也不适合筛选cDNA文库, 因而限制了该系统的应用。 1.2.2 lexa杂交系统的结构组成和特点 LexA是一种在E.coli中控