四逆汤中附子配伍甘草解毒增效作用机制研究.docxVIP

四逆汤中附子配伍甘草解毒增效作用机制研究 四逆汤由附子、甘草（炒）和干姜组成。主要用于治疗冠状动脉粥样硬化和心绞痛等紧急情况。现代临床实践和药理学研究表明, 四逆汤对心肌缺血-再灌注损伤 (MI-RI) 的心肌细胞具有明显的保护作用, 可以影响其代谢、形态及功能等。四逆汤中君药附子具回阳救逆之功, 但燥热峻猛毒烈, 配伍甘草, 以“制其偏性, 解毒存性”。目前对附子配伍甘草解毒增效机制进行了大量而有价值的研究, 但从生物体对四逆汤复方多成分之整体反应的角度阐释该机制的研究尚薄弱。本实验采用H9c2心肌细胞, 建立体外MI-RI模型, 研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制, 并采用GC-MS联用技术对细胞培养液进行代谢组学研究, 进而从代谢组学角度探讨四逆汤中附子配伍甘草的解毒增效机制。 1 材料表面 1.1 超净从根、中、省 气相色谱-质谱联用仪 (7890A GC-5975 MSD, Agilent) 、CO2培养箱 (Thermo Electron Corporation) ;立式高压蒸汽高压灭菌器 (MLS-3020, SANYO) ;双人双面超净工作台 (SW-CJ-2F) ;通用离心机 (Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo) ;酶标仪 (PC plus 384) ;透射电镜 (H-600 IV Hitachi) ;倒置显微镜 (CK40, OLYMPUS) ;氮气吹干仪 (BF 2000-15A) ;微型旋涡混合器 (WH-3) 。 1.2 酶ldh DMEM高糖培养基, 0.25%胰蛋白酶溶液 (HyClone) ;胎牛血清FBS (兰州民海生物工程有限公司) ;DMSO (成都科龙化工试剂厂) ;MTT (Solarbio公司) ;磷酸盐缓冲液 (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;链霉素 (大连美罗制药厂) ;青霉素 (华北制药厂) ;LDH, CK试剂盒 (南京建成生物工程研究所) ;乳酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、葡萄糖、果糖、甘露糖、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、棕榈酸、硬脂酸 (上海安研商贸有限公司) ;乙腈、甲醇 (Fisher Chemicals公司) ;甲氧胺盐酸盐、MSTFA、正庚烷、TMCS、吡啶 (Sigma-Aldrich公司) , 实验用水均为超纯水 (Milli-Q级) , 其余试剂均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 火提取液的制备 四逆汤样品:取生附片30 g、炙甘草30 g和干姜20 g, 置于圆底烧瓶中, 加8倍量水浸泡0.5 h, 回流提取, 武火煮沸后文火保持微沸1.5 h, 提取液趁热用纱布滤过;提取3次, 合并水提液, 减压浓缩至适量, 加去离子水定容至100 m L。 缺甘草四逆汤样品:取生附片48 g和干姜32 g, 其他操作同上, 即得缺甘草四逆汤样品溶液100 m L。 2.2 硫酸钠“缺氧”溶液的配置 取化学缺氧剂Na2S2O3溶于PBS中, 按试验中要求配制成各浓度“缺血”液, 混匀, 经0.22μm滤器滤过, 避光, 临用现配。 2.3 逆汤单次用药 SD大鼠, 清洁级, 体重 (200±20) g, 雌雄各半, 实验动物生产许可证编号SCXK (川) 2008-24, 试验前12 h禁食不禁水。随机分为3组 (正常组、四逆汤组、缺甘草四逆汤组) , 每组8只。 四逆汤组:灌胃四逆汤 (预先温热) , 给药量为20μL·g-1体重, 每天1次, 连续7 d。缺甘草四逆汤:灌胃缺甘草四逆汤 (预先温热) , 其他同四逆汤组。正常组:于第7天灌胃等量的生理盐水。末次给药后0.5 h, 眼眶后静脉丛取血, 静置1 h, 离心 (4 500 r·min-1, 10 min) , 分离血清, -70℃冷冻保存。 取含药血清和空白血清, 室温解冻, 56℃水浴灭活30 min, 用DMEM配制细胞培养液 (含血清10%) , 经0.22μm滤器滤过, 除菌, 临用现配。 2.4 生长分组和传代 H9c2大鼠心肌细胞株 (ATCC, CRL-1446, 武汉博士德生物技术公司) 于含10%FBS的DMEM完全培养基 (含青霉素100 U·m L-1、链霉素100 U·m L-1) 中培养 (培养箱条件为37℃, 5%CO2) 。贴壁生长后, 2~3 d传代1次, 按1∶4传代。状态良好的取对数生长期细胞进行试验。 2.5 实验分组及结果 调大鼠心肌细胞H9c2密度为8×104个/m L, 接种于96孔培养板, 每孔接种200μL;调细胞密度为5×104个/m L, 接种于6孔培养板, 每孔接种2m L。培养2~3 d, 待细胞覆盖率达到80%~90%时进行试验。 心肌细胞MI-RI模型的制备:更换正常细胞培养液为等量的“缺血液”