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表达产物的稳定性 外源基因在大肠杆菌中表达，表达产物对宿主菌而言，是异物，所以大肠杆菌体内常会产生一些蛋白，消化表达产物， 采用融合表达， 分泌表达， 点突变（改变外源蛋白的酶切识别位点）， 选用蛋白酶缺陷型的宿主菌 第六十二页，共一百零六页，2022年，8月28日 细胞的代谢负荷 大量复制质粒和表达外源基因，会破坏宿主菌原有的代谢平衡 减轻细胞代谢负荷的一个方法是菌体的生长和表达外源基因分为两个阶段 第六十三页，共一百零六页，2022年，8月28日 发酵条件的优化 第六十四页，共一百零六页，2022年，8月28日 二、酵母表达系统 1. 外源基因的拷贝数 相对于大肠杆菌，酵母的质粒要少得多，而整合型的质粒，如毕赤酵母，由于拷贝数可以比较高，所以现在用地非常普遍 2. 外源基因的表达效率 1）启动子 2）分泌信号的效率 3）终止序列的影响 4）偏好密码子的使用 第六十五页，共一百零六页，2022年，8月28日 3. 外源蛋白的糖基化 4. 宿主菌的选择 1）生长力强 2）内源蛋白酶活性弱 3）菌株性能稳定 4）分泌能力强 第六十六页，共一百零六页，2022年，8月28日 5. 发酵条件的优化 第六十七页，共一百零六页，2022年，8月28日 第八节 重组蛋白的复性策略 第六十八页，共一百零六页，2022年，8月28日 包含体（包涵体） ：又称光折射体，大肠杆菌高量表达外源基因时，大量的表达产物和DNA碎片、RNA、核糖体等结合在一起形成的一种颗粒 包含体中的蛋白质一般是不正确折叠的蛋白，特别是二硫键的错配 第六十九页，共一百零六页，2022年，8月28日 高效表达的目的蛋白 在大肠杆菌内形成大 量无活性包含体。 因无法有效的解决复 性问题，在美国每年 造成的经济损失就达 几十亿美元 包含体电镜图 第七十页，共一百零六页，2022年，8月28日 一、减少包含体的策略 温度 分泌表达 选用合适的宿主菌和载体 稀有密码子 第七十一页，共一百零六页，2022年，8月28日 二、包含体的复性 包含体是不溶性物质，其中的蛋白质复性一般过程是：用盐酸胍、去污剂（Triton）等处理，是蛋白变成完全随机的结构形式，然后除去变性剂，再重新折叠成结构活性的蛋白 第七十二页，共一百零六页，2022年，8月28日 包含体复性方法 溶液中复性 反胶束环境复性 分子伴侣 固相复性 第七十三页，共一百零六页，2022年，8月28日 二硫键形成的方法 空气氧化 巯基化合物 二硫键异构酶 混合二硫键交换法 第七十四页，共一百零六页，2022年，8月28日 第九节 分离纯化实例 第七十五页，共一百零六页，2022年，8月28日 啤酒酵母表达系统 毕赤酵母表达系统 裂殖酵母表达系统 汉逊酵母表达系统 第三十页，共一百零六页，2022年，8月28日 Invitrogen公司的pYES2质粒，含2μ复制序列和pUC复制起点，Amp和Ura筛选标记，GAL1启动子和CYC2终止子 pPIC9K全长9.3Kb，原核有氨苄和卡那抗性，真核中是组氨酸和HG418筛选标记，有和染色体重组的整合位点，在多克隆位点的上游有信号肽序列，用甲醇诱导表达 第三十一页，共一百零六页，2022年，8月28日 pYES2 半乳糖激酶启动子 第三十二页，共一百零六页，2022年，8月28日 pPIC9K 甲醇氧化酶启动子 目前已发现的、最强的真核启动子 第三十三页，共一百零六页，2022年，8月28日 第四节 基因工程制药上游技术 第三十四页，共一百零六页，2022年，8月28日 一、目的基因的获得 1. 化学合成法 在核酸合成以上可以自动合成一条单链的寡聚核苷酸，准确率比较高，但是费用也高 稍微长一点的基因，可以用互为引物PCR方法获得 再长一点的基因，可以用几个粘末端的双链片段通过连接酶连接组装而成 第三十五页，共一百零六页，2022年，8月28日 2. PCR法 如果知道基因序列，且基因没有内含子，就可以通过合成引物，通过PCR的方法人工合成基因 3. 逆转录法 对有内含子的基因常采用的方法，具体工程为：提取细胞或组织的总RNA，用逆转录酶和OligodT合成cDNA的第一链，再通过PCR方法合成第二连 第三十六页，共一百零六页，2022年，8月28日 二、目的基因的克隆 一般是将目的基因连接到T载体上，但有时候这一步可以省略 第三十七页，共一百零六页，2022年，8月28日 三、基因的体外重组 双酶切T载体和表达载体，体外连接 第三十八页，共一百零六页，2022年，8月28日 四、重组产物转入到宿主菌中 体外连接的产物，用合适的方法转入到宿主菌中