基因工程-重组子筛选(中国药科大学生物工程所有课件).ppt

转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。;选择(selection) ：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。 筛选(screening)：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程 由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特异的筛选方法。;外源DNA;获得转化子仍然是多种类型的DNA分子 1 连接产物中既有载体和一个或多个串联目的基因的连接； 2 也有载体自连； 3 还有目的DNA分子自连； 4 更多的是未发生连接反应的载体和目的DNA片段;一、遗传检测法 报告基因筛选、 抗性标志插入失活筛选、 半乳糖苷酶蓝白斑筛选、 插入基因遗传性状筛选、 二、分子检测法 PCR扩增检测 分子杂交检测 三、物理检测法 DNA电泳检测 限制酶酶切分析法 四、免疫化学检测法 五、核酸序列分析;一、遗传学检测法; ;（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因：产生?-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸 （3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。;;氨苄青霉素抗性插入失活选择过程;pUC18/19;?-半乳糖苷酶显色反应选择法;假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏?肽）。;通过看培育皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;无质粒的 受体菌;利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。;小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶(三甲氧苄氨嘧啶（TMP,抑制二氢叶酸还原酶，干扰二氢叶酸的合成，使细菌或球虫的核酸合成受阻 )有抗性。;利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;依据重组DNA分子大小鉴定重组子 原理：有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异。 基本方法：提取转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离，电泳迁移慢的带是重组DNA的带。 此法是对重组子进行分析鉴定??最基本、最简洁的方法，只适用于重组子的初步鉴定。;2.酶切电泳筛选法;;筛选过程;二、分子检测法;PCR扩增检测法;例 PCR检测;DNA序列分析鉴定;; 具有互补序列两条单链核酸分子在肯定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列且已标记的DNA或RNA,称探针。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。 ;四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。依据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。 ;（1）菌落印记原位杂交筛选;此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。 ;Paper Towels;带有DNA片段的凝胶;;转膜的几种方式;;;(3)Northern blotting;利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。;待测基因 产物蛋白;2. 放射性抗体检测法过程;(2). Broome-Gilbert双位点检测法;固相支 持滤膜;(3).免疫沉淀检测法;对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。;(4).酶联免疫吸附测定（ELISA）;待测基因 产物蛋白;2. ELISA检测的一般步骤;加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。;3.ELISA的局限性;临床检验常用的单抗;(5).免疫印迹（western blotting）法;② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：;③蛋白质电泳的分子量标准;④凝胶中的蛋白质染色：;2）Western blotting;Western装置;② Blotting;先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合；;④结果;六、转译筛选法 ;2.转译筛选;3.杂交抑制转译法;2. 过程;4.杂交释放转译法;过程;专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。;一般克隆与筛选策略;七、几种常用的真核生物重组基因选择方法;②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用;